體液免疫檢測(cè)法
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體液免疫檢測(cè)法(assay of humoral immunity)，檢測(cè)體液免疫功能的技術(shù)。分為體外檢測(cè)和體內(nèi)檢測(cè)。體外體液免疫檢測(cè)法包括抗原抗體反應(yīng)、體液中各種可溶性免疫因素測(cè)定，體內(nèi)檢測(cè)為體液免疫測(cè)定技術(shù)。
目錄 |
體外體液免疫功能測(cè)定技術(shù)
包括兩大類：抗原抗體反應(yīng)和可溶性免疫分子測(cè)定。
抗原抗體反應(yīng)
由于抗體主要存在于血清中，檢測(cè)時(shí)需要自血液中分離出血清為標(biāo)本（待檢材料），故又名為血清學(xué)試驗(yàn)。抗原與抗體反應(yīng)具有高度特異性（專一性、針對(duì)性），因此只要其中的一種為已知，即可檢測(cè)另一方。如用已知抗原檢測(cè)未知抗體，或用已知抗體來鑒定、檢測(cè)未知抗原。
抗原與抗體在體外反應(yīng)，可因抗原的物理性狀不同或參與反應(yīng)的成分不同而表現(xiàn)各種反應(yīng)現(xiàn)象，如凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合以及中和反應(yīng)等。此四種反應(yīng)類型即所謂“經(jīng)典”的血清學(xué)反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行技術(shù)改良，又衍生出很多快速、敏感及微量的抗原抗體反應(yīng)，在實(shí)際應(yīng)用中已極為廣泛。
在血清學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，近代免疫學(xué)技術(shù)中又迅速地建立了免疫標(biāo)記技術(shù)，包括免疫熒光標(biāo)記技術(shù)、免疫酶標(biāo)記技術(shù)、放射性核素標(biāo)記技術(shù)、生物素－親和素技術(shù)及發(fā)光免疫技術(shù)。
①凝集反應(yīng)。即顆粒性抗原（如完整的細(xì)菌、立克次氏體、螺旋體及紅細(xì)胞懸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼看見的凝集團(tuán)塊或顆粒。包括直接凝集反應(yīng)、間接凝集反應(yīng)及抗球蛋白反應(yīng)等。
直接凝集反應(yīng)即顆粒性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的適合條件下直接結(jié)合，出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。這類反應(yīng)常用于血型測(cè)定、病原菌的鑒定等，如診斷傷寒或副傷寒的維達(dá)爾（曾譯肥達(dá)）氏試驗(yàn)等。
間接凝集反應(yīng)是在直接凝集反應(yīng)的基礎(chǔ)上衍生而來。即將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與本免疫試驗(yàn)無關(guān)的、有一定體積的顆粒狀物質(zhì)(稱為載體)表面，然后再與相應(yīng)的抗體（或抗原）作用，在電解質(zhì)存在的適宜條件下發(fā)生凝集?？晒┳鲚d體用的有人“ O”型紅細(xì)胞或某些動(dòng)物（如綿羊、兔等）的紅細(xì)胞及某些隋性顆粒，如聚苯乙烯乳膠顆粒或活性炭等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，當(dāng)顆粒上吸附的抗原與微量抗體相結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見的凝聚反應(yīng)，因此其敏感性比直接凝集要高出數(shù)倍至數(shù)十倍，可以測(cè)定毫微克水平。另外，吸附在載體上的抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)使載體被動(dòng)地凝集在一起，故又稱為被動(dòng)凝集。將抗原吸附于載體之上，然后再與相應(yīng)抗體相結(jié)合出現(xiàn)凝集反應(yīng)者稱為正向間接凝集反應(yīng)，可用于測(cè)定某些病原微生物的相應(yīng)抗體（如痢疾桿菌的糞抗體）或檢測(cè)某些自身免疫性疾病的自身抗體(如甲狀腺球蛋白抗體、類風(fēng)濕性因子、抗DNA抗體等)。反之，將抗體吸附于顆粒載體之上與相應(yīng)抗原結(jié)合，則稱為反向間接凝集反應(yīng)。有高度敏感性和特異性，可用于某些傳染病、腫瘤的早期診斷，檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白、鉤端螺旋體、腦膜炎雙球菌、鼠疫桿菌、布魯斯氏桿菌等微量抗原。若將可溶性抗原先與抗體反應(yīng)，然后再檢測(cè)抗體能否與吸附于顆粒載體上的抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，如果抗體已與先加入的抗原結(jié)合，那么就沒有或僅剩少量抗體再與載體上的抗原結(jié)合，因此不出現(xiàn)凝集反應(yīng)或反應(yīng)很微弱，這稱為間接凝集抑制試驗(yàn)，常用來檢測(cè)可溶性抗原。
抗球蛋白反應(yīng)又稱橋梁凝集反應(yīng)。用于測(cè)定不完全抗體（又稱短臂抗體），如免疫球蛋白G(IgG)，是一種極為敏感、可靠的方法。機(jī)體接受抗原刺激后除產(chǎn)生完全抗體(抗體長，體積大)外，還能產(chǎn)生不完全抗體（抗體短，體積?。?，只能與一方抗原決定簇結(jié)合，而不能同時(shí)與另一方抗原決定簇聯(lián)接，因此不能出現(xiàn)直接可見的凝集反應(yīng)。庫姆斯等首先根據(jù)“抗體存在于球蛋白，球蛋白本身注入異種動(dòng)物亦是抗原”的原理，把產(chǎn)生不完全抗體的人的正常血清球蛋白注射到異種動(dòng)物如兔、綿羊等體內(nèi)，使之產(chǎn)生抗球蛋白抗體，將抗球蛋白抗體加到抗原與不完全抗體的復(fù)合物中，使其起搭橋作用，就能出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)。此試驗(yàn)亦稱庫姆斯氏反應(yīng)。
庫姆斯氏反應(yīng)可分為直接反應(yīng)和間接反應(yīng)。直接庫姆斯氏反應(yīng)是檢測(cè)粘附在以紅細(xì)胞為抗原的表面上的不完全抗體（即自身紅細(xì)胞抗體）最有效的方法之一。利用抗球蛋白抗血清為反應(yīng)試劑。當(dāng)抗球蛋白抗體與紅細(xì)胞表面上粘附的不完全抗體結(jié)合后，就提供了一個(gè)較長的臂（橋梁），使紅細(xì)胞出現(xiàn)可見的直接凝集現(xiàn)象。本法常用于診斷新生兒溶血性疾病和自身免疫性溶血性貧血。間接庫姆斯氏反應(yīng)是檢測(cè)血清中的游離的不完全抗體。將病人血清加入有相應(yīng)抗原的一定濃度的紅細(xì)胞懸液中，在一定條件下相互作用，然后加入抗球蛋白試劑。若病人血清中有不完全抗體存在，則紅細(xì)胞出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)。本法常用于血型抗原的判定、血型抗體的檢測(cè)和鑒定，以及輸血前的血型相溶性試驗(yàn)。
②沉淀反應(yīng)。指可溶性抗原（如血清蛋白、細(xì)菌培養(yǎng)濾液、細(xì)菌浸出液、組織浸出液等）與相應(yīng)的抗體在有電解質(zhì)存在的條件下結(jié)合，經(jīng)過一定時(shí)間后，形成肉眼可見的白色沉淀物。參加反應(yīng)的可溶性抗原為多糖、蛋白質(zhì)、類脂等，可溶性抗原與相應(yīng)抗體比較，前者分子小，單位體積內(nèi)所含的抗原分子多，與抗體結(jié)合的總面積大，沉淀物的形成主要通過抗體球蛋白將抗原分子交叉聯(lián)接所形成。為了使抗原與抗體之間的比例適合，一般可稀釋抗原并以仍可出現(xiàn)沉淀反應(yīng)的抗原最高稀釋度為抗體血清的效價(jià)。
沉淀反應(yīng)技術(shù)由于特異性很強(qiáng)，而被廣泛應(yīng)用于鑒定混合物中蛋白質(zhì)組分，鑒定菌型，診斷疾病以及在法醫(yī)上鑒定血跡等。如檢查梅毒抗體的康氏反應(yīng)。
沉淀反應(yīng)主要有環(huán)狀沉淀反應(yīng)(對(duì)抗原的定性試驗(yàn))、絮狀沉淀反應(yīng)（測(cè)定毒素及抗毒素等）。目前應(yīng)用廣泛的是瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，可用以測(cè)定免疫球蛋白，補(bǔ)體各組分的含量，分析和鑒定復(fù)雜的抗原物質(zhì)成分，測(cè)定抗原、抗體提取后的純度等。
環(huán)狀沉淀反應(yīng)是在細(xì)口徑的小試管內(nèi)先加入已知抗體血清，再將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的待檢可溶性抗原沿管壁小心加在抗血清表面，使形成界面清晰的兩層。數(shù)分鐘后，若在兩層液面交界處出現(xiàn)白色沉淀環(huán)，即為陽性反應(yīng)。本試驗(yàn)可用于抗原的定性試驗(yàn)，診斷炭疽，檢測(cè)媒介昆蟲的嗜血性，測(cè)定C反應(yīng)蛋白，并廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生檢驗(yàn)、考古及法醫(yī)等。
瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)為可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含有電解質(zhì)的半固體凝膠（瓊脂或瓊脂糖）中進(jìn)行的一種沉淀試驗(yàn)。瓊脂在實(shí)驗(yàn)中只起網(wǎng)架作用，含水量為99％，可溶性抗原與抗體在其間可以自由擴(kuò)散，若抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，比例合適，在相遇處可形成白色沉淀線，是為陽性反應(yīng)。沉淀線在凝膠中可長時(shí)間保持固定位置并可經(jīng)染色后干燥保存。沉淀線（帶）對(duì)抗原與抗體具有特異的不可透性，而非特異者則否。所以一個(gè)沉淀線（帶）即代表一種抗原與抗體的沉淀物，因而本試驗(yàn)可對(duì)溶液中不同抗原抗體系統(tǒng)進(jìn)行分析研究。
本試驗(yàn)包括單向、雙向瓊脂擴(kuò)散兩種基本類型。若結(jié)合電泳技術(shù)進(jìn)行定向擴(kuò)散，可加快擴(kuò)散速度、提高反應(yīng)靈敏度，因而又衍生出對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、免疫電泳及交叉免疫電泳等。瓊脂擴(kuò)散可在試管、平皿或玻片上進(jìn)行，一般實(shí)驗(yàn)室常采用玻片法。
雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是在含有電解質(zhì)的半固體瓊脂板上，將可溶性抗原和抗體分別加入具有一定距離和孔徑的小孔內(nèi)，使其在一定條件下相互擴(kuò)散，兩者在比例合適處相遇，形成白色沉淀線（帶）。當(dāng)存在多種抗原抗體系統(tǒng)時(shí)可出現(xiàn)多條沉淀線，然后可根據(jù)沉淀線的數(shù)目、位置、形狀對(duì)抗原抗體系統(tǒng)進(jìn)行分析。
反應(yīng)的基本類型有下列幾種，當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體相互擴(kuò)散即形成一條沉淀線。兩種抗原相同時(shí)表現(xiàn)為融合沉淀線。兩種抗原完全不相同時(shí)形成獨(dú)立的沉淀線，同時(shí)兩條沉淀線可出現(xiàn)交叉，屬非同一性反應(yīng)。兩種抗原有部分相同時(shí)，與相應(yīng)抗體進(jìn)行擴(kuò)散后，可形成兩條既相互聯(lián)接又有其中一條多出一小段的沉淀線。抗體與含有多種及部分相同的兩種抗原相互擴(kuò)散后，除形成一條同一性的弧形融合沉淀線外，又形成兩條非同一性反應(yīng)的沉淀線。
沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原抗體的特異性，而且與濃度、分子的大小及擴(kuò)散速度有關(guān)。本試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)為特異性強(qiáng)，缺點(diǎn)是時(shí)間長，靈敏度低。
單向瓊脂擴(kuò)散又稱單向環(huán)狀免疫擴(kuò)散，是一種定量測(cè)定抗原的方法。常用來檢測(cè)標(biāo)本中各種免疫球蛋白及血清中各種補(bǔ)體成分的含量。靈敏度高，可對(duì)免疫性疾病作輔助診斷。
針對(duì)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的時(shí)間長、靈敏度較低的問題，根據(jù)有些攜帶電荷的物質(zhì)如多肽、核酸、蛋白質(zhì)等在電場(chǎng)作用下可向相反電荷的電極移動(dòng)的原理，建立了免疫電泳技術(shù)。常用的有醋酸纖維膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、免疫電泳及交叉免疫電泳等。
對(duì)流免疫電泳是在雙向瓊脂擴(kuò)散的基礎(chǔ)上進(jìn)行電泳。即在含電解質(zhì)的半固體瓊脂板上將抗原抗體分別加入具有一定距離和孔徑的小孔內(nèi)，然后將此瓊脂板置于電場(chǎng)下，在一定條件下抗原向陽極移動(dòng)，抗體在電滲作用下向陰極移動(dòng)，兩者在最適比例處相遇而形成沉淀線。由于電場(chǎng)能限制抗原抗體的自由擴(kuò)散傾向，使兩者只能向一定方向移動(dòng)，因此提高了試驗(yàn)的靈敏度并縮短時(shí)間。本試驗(yàn)常用于檢測(cè)血清中乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)、甲胎蛋白，各類免疫球蛋白的定性和半定量。缺點(diǎn)是無分辨力，當(dāng)待檢抗原（血清）中存在兩種以上成分時(shí)則形成重疊沉淀線造成無法分辨。
火箭電泳又稱電泳免疫擴(kuò)散。是單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的方法。是一種定量試驗(yàn)。在電場(chǎng)作用下抗原在含有一定量抗體的瓊脂板中形成錐形沉淀峰，形似火箭，故名。沉淀峰的高低與抗原濃度成正比，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中可查出被檢測(cè)樣品中抗原的含量。此試驗(yàn)快速、敏感，相似于單向擴(kuò)散。若抗原中加入少量放射性核素標(biāo)記，可作放射免疫自顯影檢測(cè)微量抗原。本試驗(yàn)常用于定量檢測(cè)免疫球蛋白、白蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、甲胎蛋白及其他抗原性蛋白質(zhì)的含量。
免疫電泳是瓊脂區(qū)帶電泳與雙向瓊脂擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合，用來分析抗原組分的免疫化學(xué)分析技術(shù)。根據(jù)沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與已知標(biāo)準(zhǔn)抗原在同一瓊脂板上所形成的沉淀弧進(jìn)行比較即可分析待檢樣品中所含成分及其性質(zhì)。本試驗(yàn)的特點(diǎn)為檢測(cè)樣品用量小、分辨力高、特異性強(qiáng)，但敏感度較弱?？捎糜诜治鲅宓鞍壮煞?，也可用于分析抗原、抗體提純程度，研究抗體成分、免疫后抗體組分的動(dòng)態(tài)變化等。
交叉免疫電泳是免疫電泳與火箭電泳的結(jié)合。即先將抗原（待檢樣品）進(jìn)行區(qū)帶電泳，然后再進(jìn)行火箭電泳，在電場(chǎng)作用下形成獨(dú)立錐形沉淀峰。對(duì)抗原中各組分容易進(jìn)行比較，可定性，也可半定量。
③補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體一旦被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后，即不再游離，故可利用此特點(diǎn)進(jìn)行免疫反應(yīng)的研究。實(shí)驗(yàn)室常用的補(bǔ)體多來源于豚鼠的新鮮血清。
補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常應(yīng)用的有：溶血反應(yīng)與溶菌反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)及免疫粘附血凝試驗(yàn)等。
補(bǔ)體的溶血、溶菌作用有賴于抗體的存在。紅細(xì)胞抗原與相應(yīng)的紅細(xì)胞抗體（又稱溶血素）結(jié)合，在電解質(zhì)溶液中可發(fā)生凝集反應(yīng)，但在有補(bǔ)體參與反應(yīng)時(shí)紅細(xì)胞可被溶解，這稱為免疫溶血。在輸血時(shí)血型不合亦可致溶血反應(yīng)。體外抗體形成細(xì)胞檢查法又稱溶血空斑試驗(yàn)，是在細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)觀察檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況的一種溶血反應(yīng)。在產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞周圍，出現(xiàn)一個(gè)因紅細(xì)胞溶解形成的透明區(qū)，此抗體生成淋巴細(xì)胞稱為空斑形成細(xì)胞。所形成空斑的數(shù)量可精確地反映機(jī)體的體液免疫功能狀態(tài)。
當(dāng)抗原為某些革蘭氏陰性細(xì)菌(如霍亂弧菌)的，與相應(yīng)抗體結(jié)合后，若有補(bǔ)體參與則細(xì)菌可被溶解或破壞，這稱為溶菌反應(yīng)。
補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞與溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。這種反應(yīng)包括兩個(gè)系統(tǒng)、五種成分：即指示系統(tǒng)及實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)；綿羊紅細(xì)胞、溶血素、補(bǔ)體、待檢血清(或已知抗體)、已知抗原（或待檢抗原）。借助指示系統(tǒng)是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象來說明試驗(yàn)系統(tǒng)中的抗原與抗體是否有特異性反應(yīng)。從試驗(yàn)系統(tǒng)中加入已知抗原及補(bǔ)體，若其中存在待測(cè)抗體，則補(bǔ)體被用完。將這系統(tǒng)放入4℃冰箱過夜，再經(jīng)37℃水浴30分鐘，又加入指示系統(tǒng)中。當(dāng)指示系統(tǒng)不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性，溶血?jiǎng)t為陰性反應(yīng)。本試驗(yàn)敏感性、特異性均較高，但實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣。常用來檢測(cè)血清中的抗體，如診斷病毒性疾病、梅毒及鉤端螺旋體病等;也可用來鑒定自病人體內(nèi)分離的病原微生物如病毒、立克次氏體等，如檢查梅毒的瓦瑟曼氏反應(yīng)。
免疫粘附血凝試驗(yàn)原理是抗原抗體復(fù)合物能固定補(bǔ)體，當(dāng)具有補(bǔ)體(C3b)受體的細(xì)胞（如人O型紅細(xì)胞）存在時(shí)，則抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物上的C3b與紅細(xì)胞表面C3b受體結(jié)合而引起紅細(xì)胞凝集。是檢測(cè)抗原、抗體或補(bǔ)體量的高度敏感方法，比補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的敏感度高數(shù)倍至數(shù)百倍。常用于檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。
④免疫標(biāo)記技術(shù)。是將放射性核素、熒光素或酶活性物質(zhì)標(biāo)記于抗體或抗原表面，能使在一般實(shí)驗(yàn)方法中不能觀察到的抗原抗體反應(yīng)得以顯示出來。不僅可大大提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性，同時(shí)可對(duì)微量物質(zhì)進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，并可結(jié)合顯微鏡、電鏡技術(shù)對(duì)待檢物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的精確定位，對(duì)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床理論探討及臨床疾病診斷均提供了有利手段和重要工具，應(yīng)用極為廣泛。
根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)與方法的不同包括多種。
放射性核素標(biāo)記抗原抗體反應(yīng)是將放射性核素分析的高度靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性兩大特點(diǎn)相結(jié)合而建立的檢測(cè)技術(shù)。敏感性高、特異性強(qiáng)，尤其具有很高的精確性，能檢測(cè)到μg/ml以至ng/ml水平。常用的放射性核素有3H、14C、35S、32P、15N、131L和 125I等。其中3H和14C應(yīng)用最多。3H標(biāo)記摻入快、游離少、射線短、定位準(zhǔn)確，14C只放射出β粒子，具有足夠能量，測(cè)定較易，外照射弱，半衰期長，適于長時(shí)間的連續(xù)示蹤試驗(yàn)。放射性核素標(biāo)記法可分為內(nèi)標(biāo)記法和外標(biāo)記法。內(nèi)標(biāo)記法是用3H、14C等標(biāo)記氨基酸或核苷酸。將標(biāo)記物加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)物中，細(xì)胞在合成蛋白質(zhì)或核酸過程中攝取攜帶標(biāo)記3H(14C)的氨基酸或核苷酸，使細(xì)胞內(nèi)含有放射性標(biāo)記物。利用此方法能研究DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成的位置及動(dòng)態(tài)，研究遺傳物質(zhì)的復(fù)制，細(xì)胞的融合，細(xì)胞膜功能，致癌作用及藥物作用等。外標(biāo)記法是將放射性131L或125I直接結(jié)合到抗原或抗體分子上，采用氯胺T法。氯胺T為一種緩和氧化劑，在氨胺T作用下，碘分子與蛋白分子中的主要酪氨酸結(jié)合，蛋白質(zhì)被放射性核素標(biāo)記。
常用的放射免疫測(cè)定技術(shù)有放射免疫測(cè)定法和放射免疫沉淀自顯影法。
免疫熒光技術(shù)是以熒光素為標(biāo)記物，標(biāo)記于抗體分子上，不影響抗體的免疫學(xué)特性。以標(biāo)記熒光素的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用來檢測(cè)未知的抗原，在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)熒光特性的抗原抗體復(fù)合物的存在部位。是將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性、敏感性與顯微鏡技術(shù)的準(zhǔn)確性相結(jié)合。應(yīng)用廣泛。熒光素為一種染料，在紫外光或藍(lán)紫光照射下能吸收光量子而被激化，放出波長較激發(fā)光長的熒光。最常用的熒光素有異硫氰熒光素和羅丹明。
熒光抗體技術(shù)分為三種。直接法為最簡單、最基本的方法。是將熒光標(biāo)記抗體直接加到待檢標(biāo)本上，在熒光顯微鏡下直接觀察有熒光特性的抗原抗體復(fù)合物。此法特異性最強(qiáng)，但敏感性較差，同時(shí)因抗體種類繁多，而又需各個(gè)標(biāo)記，因而相對(duì)又很復(fù)雜。間接法是首先將熒光素標(biāo)記抗球蛋白抗體（又稱為抗抗體），然后將待檢測(cè)抗原與相應(yīng)抗體相互作用，最后再與熒光素標(biāo)記的抗球蛋白抗體作用，陽性反應(yīng)可形成抗原—抗體—熒光素標(biāo)記抗球蛋白抗體復(fù)合物?？捎脕龛b定未知抗原。敏感性高于直接法，操作簡便，只需制備一種熒光素標(biāo)記的抗球蛋白抗體即可檢測(cè)同種動(dòng)物的多種抗原抗體系統(tǒng)，但本法易產(chǎn)生非特異性熒光現(xiàn)象，而影響特異性。
補(bǔ)體法與間接法原理相同。即利用補(bǔ)體能與抗原抗體結(jié)合的特性，將熒光素標(biāo)記于抗補(bǔ)體抗體。方法是將抗體、補(bǔ)體與待鑒定抗原作用后，再與熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體作用。陽性反應(yīng)可形成抗原—抗體—補(bǔ)體—熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體大分子復(fù)合物。優(yōu)點(diǎn)為應(yīng)用方便，只需制備一種標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體即可檢測(cè)多種抗原抗體系統(tǒng)，抗體來源不受動(dòng)物種屬限制，敏感性高于間接法，但操作過程較繁瑣，易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。常用于檢測(cè)組織內(nèi)補(bǔ)體沉淀，免疫復(fù)合物及固定補(bǔ)體的抗體等，可借以診斷免疫復(fù)合物性疾病及自身免疫病。
免疫酶技術(shù)是以酶作為標(biāo)記物，即酶標(biāo)記抗體（或抗原）檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的抗原(或抗體)的一種定位、定性和定量技術(shù)。是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效專一催化底物的能力結(jié)合而建立的一種新的血清學(xué)反應(yīng)。用化學(xué)方法處理，使酶與抗體（或抗原）結(jié)合，形成酶標(biāo)記物并仍保持抗體（或抗原）的免疫特異性和酶活性。當(dāng)酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原（或抗體）相反應(yīng)而形成酶標(biāo)記物—抗原（或抗體）的免疫復(fù)合物后，在遇到相應(yīng)酶底物時(shí)可進(jìn)行催化其水解、氧化還原的反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物。酶降解底物的數(shù)量與所呈現(xiàn)的色澤濃度成正比。由此可計(jì)算出被檢測(cè)的抗原（或抗體）的含量。經(jīng)常被選作標(biāo)記物的酶有辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶及6-磷酸葡萄糖酶等，目前多采用HRP。
免疫酶技術(shù)可分為免疫酶染色和酶免疫測(cè)定。免疫酶染色與免疫熒光技術(shù)相似，但標(biāo)記物不同。當(dāng)酶標(biāo)記抗體（或抗原）與相應(yīng)抗原（或抗體）特異結(jié)合后，在加入酶底物時(shí)，底物在酶的催化下生成不溶性沉淀物并發(fā)生組織化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生有顏色物質(zhì)，可在光學(xué)顯微鏡下觀察。出現(xiàn)顏色反應(yīng)的部位即是酶標(biāo)記抗體與相應(yīng)抗原特異結(jié)合的部位，亦即所檢測(cè)的抗原（或抗體）存在部位。利用本試驗(yàn)可進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原或抗體定位及半定量研究。酶免疫測(cè)定 (EIA)在酶免疫組織化學(xué)法和放射免疫測(cè)定法的基礎(chǔ)上發(fā)展建立，是用來檢測(cè)體液中的微量抗原或抗體的定量方法。用酶標(biāo)記已知抗體或抗球蛋白抗體（抗抗體）或抗原，再與待檢測(cè)的材料混合，反應(yīng)后加入酶的底物，若生成可溶性有顏色產(chǎn)物可根據(jù)呈色程度用肉眼觀察，為定性測(cè)定；或用分光光度計(jì)來測(cè)定，可進(jìn)行定量測(cè)定。
在酶免疫測(cè)定法的基礎(chǔ)上經(jīng)改進(jìn)后建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和酶放大免疫試驗(yàn)。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)又稱酶標(biāo)法，是將可溶性抗原或抗體吸附在固相載體上（如聚苯乙烯板、管、珠），再與酶標(biāo)記抗體或抗原相結(jié)合，然后根據(jù)檢測(cè)分解酶底物量的差異計(jì)算被檢測(cè)的抗原或抗體的含量。常用的有間接法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭抑制法。
酶放大免疫試驗(yàn)是利用競(jìng)爭原理直接檢測(cè)小分子抗原的一種快速簡便方法，即將酶標(biāo)記半抗原與相應(yīng)抗體及待檢樣器混合作用后檢測(cè)酶活性，若樣品中不含半抗原，則酶標(biāo)記半抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，酶活性被抑制;反之，待檢樣品中含有半抗原，則酶標(biāo)記半抗原與樣品中的半抗原共同競(jìng)爭有限的抗體，而使酶活性受抑制減少，然后通過測(cè)定酶活性的多少來反映待檢材料中是否存在半抗原及其含量。此試驗(yàn)可直接、快速檢測(cè)體液中藥物、激素的濃度。
免疫酶技術(shù)有特異性、敏感性、快速簡便實(shí)用、經(jīng)濟(jì)，可在普通實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，廣泛用于生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、血液病、流行病與傳染病中。
生物素—親和素試驗(yàn)是較新的方法。生物素—親和素系統(tǒng)是70年代后期發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。此系統(tǒng)有特殊放大作用，可顯著地提高檢測(cè)的敏感性，同時(shí)又具有高度的特異性與穩(wěn)定性，故廣泛應(yīng)用于酶、熒光素、放射性核素、鐵蛋白等標(biāo)記反應(yīng)中。
生物素廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，結(jié)構(gòu)簡單，為小分子物質(zhì)，一旦活化后可以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)蛋白質(zhì)、核酸和多糖類物質(zhì)、細(xì)胞膜表面物質(zhì)及其他標(biāo)記物，結(jié)合十分穩(wěn)定。
親和素分子為堿性蛋白質(zhì)，親和素與生物素之間有很強(qiáng)的親和力，結(jié)合十分穩(wěn)定難以解離，也不受酸、堿及酶類影響。親和素為糖蛋白，可直接偶聯(lián)各種標(biāo)記材料如酶、熒光素、放射性核素及鐵蛋白等。因此生物素—親和素系統(tǒng)可以它的一端偶聯(lián)大分子反應(yīng)物質(zhì)，另一端聯(lián)接標(biāo)記物或支持物而產(chǎn)生多極放大作用，建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速而又經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。
常用的實(shí)驗(yàn)為ABC酶標(biāo)記法。親和素(A)與小分子生物素(B)之間有高度親和力，一個(gè)A可與4個(gè)B結(jié)合，而B又可與酶標(biāo)記物(P)結(jié)合，A作為橋梁將B-P聯(lián)接在一起，完成酶標(biāo)記免疫染色檢測(cè)。
發(fā)光免疫技術(shù) (LIA)即將化學(xué)發(fā)光與免疫測(cè)定法相結(jié)合的技術(shù)。特點(diǎn)是利用化學(xué)或生物學(xué)發(fā)光系統(tǒng)作為抗原抗體反應(yīng)的指示系統(tǒng)，借以確立檢測(cè)抗原或抗體的方法。發(fā)光物質(zhì)既可直接作用于抗原或抗體的標(biāo)記物，也可以游離的形式用于催化劑（酶）和輔助劑標(biāo)記的抗原或抗體的發(fā)光反應(yīng)中。此法簡便、快速、靈敏、重復(fù)性好、設(shè)備簡單，故發(fā)展迅速。根據(jù)發(fā)光物質(zhì)應(yīng)用方式不同，發(fā)光免疫測(cè)定法有以下幾種，即發(fā)光免疫測(cè)定法、發(fā)光酶免疫測(cè)定法、發(fā)光酶放大免疫測(cè)定法、發(fā)光輔助因子免疫測(cè)定法等。
體液中各種可溶性免疫分子測(cè)定技術(shù)
包括：
①人血清中補(bǔ)體水平的測(cè)定。常用方法有測(cè)定血清總補(bǔ)體活性(CH50)及補(bǔ)體各種成分的測(cè)定。
新鮮人血清中含有補(bǔ)體，當(dāng)它與以綿羊紅細(xì)胞為抗原及相應(yīng)抗體（溶血素）相互作用后，在一定條件下發(fā)生溶血反應(yīng)。溶血的程度與血清中含有補(bǔ)體的量成正比。根據(jù)產(chǎn)生50％溶血所需要的最小補(bǔ)體量計(jì)算出血清中總補(bǔ)體活性并以CH50單位/毫升表示。人血清總補(bǔ)體活性的正常值為30～40CH50單位/毫升。
在補(bǔ)體的各種成分中C3不但含量高，而且在經(jīng)典活化途徑或旁路活化途徑中均起著承前啟后的樞紐作用，因而測(cè)定C3含量具有重要的生物學(xué)意義。測(cè)定方法可利用單向免疫擴(kuò)散法。C3的含量變化對(duì)某些疾病的診斷、預(yù)后等有所幫助，如免疫復(fù)合物性疾病、急性腎炎、肝炎等。
②免疫球蛋白定量測(cè)定。測(cè)定方法很多，常用的方法為單向免疫擴(kuò)散法，可測(cè)定血清中 IgG、IgM、IgA的含量，其正常值IgG10±2mg/ml、IgM0.4～2mg/ml、IgA1.4～4mg/ml。
③循環(huán)免疫復(fù)合物的檢測(cè)。正常情況下形成的免疫復(fù)合物能被機(jī)體的防御系統(tǒng)所清除。但在一定條件下，免疫復(fù)合物為可溶性，并不能為吞噬系統(tǒng)清除而能隨血液流經(jīng)身體各部位，在某些部位如血管壁內(nèi)、組織內(nèi)沉積。由于抗原抗體復(fù)合物能激活補(bǔ)體，從而引起一系列連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致免疫復(fù)合物性疾病。檢測(cè)組織內(nèi)或體液中的免疫復(fù)合物有助于對(duì)某些疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE)、類風(fēng)濕病、腎小球性腎炎等的診斷。組織中免疫復(fù)合物的測(cè)定多采用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法。體液中免疫復(fù)合物的測(cè)定方法有抗原非特異及抗原特異方法，目前多采用前者。
體液免疫體內(nèi)功能測(cè)定技術(shù)
包括以下兩類。
速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)皮膚試驗(yàn)
如異種動(dòng)物免疫血清，青霉素皮膚試驗(yàn)（為I型變態(tài)反應(yīng)，借以了解機(jī)體的敏感性）。
毒素皮膚試驗(yàn)
如?？耸显囼?yàn)（白喉毒素注入前臂皮內(nèi)，以同樣毒素加熱破壞其毒性，注入另一側(cè)前臂作對(duì)照。陽性反應(yīng)表示對(duì)白喉無免疫力，缺乏IgG抗白喉類毒素抗體；陰性反應(yīng)為有免疫力）和狄克氏試驗(yàn)（將小劑量鏈球菌紅斑毒素注射前臂屈面皮內(nèi)，24小時(shí)后局部出現(xiàn)紅疹，則表明體內(nèi)無相應(yīng)抗體，若局部無紅暈則表明有免疫力）。
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