免疫熒光
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免疫熒光（immunofluorescence technic）
免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）?！∮?a href="/index.php?title=%E8%8D%A7%E5%85%89%E6%8A%97%E4%BD%93&action=edit&redlink=1" class="new" title="熒光抗體（尚未撰寫）" rel="nofollow">熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因?yàn)?a href="/index.php?title=%E8%8D%A7%E5%85%89%E8%89%B2%E7%B4%A0&action=edit&redlink=1" class="new" title="熒光色素（尚未撰寫）" rel="nofollow">熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)?！ ?/p>
目錄 |
技術(shù)特點(diǎn)
該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。
熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。
由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用?！ ?/p>
原理
免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)?！ ?/p>
直接法
將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢?！ ?/p>
間接法
如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷?！ ?/p>
技術(shù)分類
⑴ 熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))
抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法?！ ?/p>
⑵ 免疫熒光測定技術(shù)
抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法
（1）熒光物質(zhì)
1）熒光色素
許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
(1)異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：
有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
(2)四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：
最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。
(3)四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：
最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異?a href="/w/%E6%B0%B0%E5%9F%BA" title="氰基">氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。
（2）其他熒光物質(zhì)
1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。
2）鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3
螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。
常見熒光素
1）FITC
2）RB200
3）TRITC
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE
6）其它
常見熒光素的特性
1）FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。
2）RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595~600nm，橘紅色熒光。
3）TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光 595nm，紅色熒光。
6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。
酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)
酶 底物 產(chǎn)物 激發(fā)光 發(fā)射光
Β-G MUG MU 360 450
AP MUP MU 360 450
HRP HPA 二聚體 317 414
（4）合適熒光素的選擇
1）具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。
熒光素-N=C +NH-蛋白質(zhì) 熒光素-N-C-N-蛋白質(zhì)
‖ ︱ ︱‖ ︱
S H H S H
2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。
3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。
5）標(biāo)記方法簡單、快速。
6）安全無毒
免疫熒光技術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟
1. 直接免疫熒光法測抗原
（1）基本原理
將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
（2）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（3）實(shí)驗(yàn)步驟
① 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。
② 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。
④ 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
⑤ 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：
（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。
（4）注意事項(xiàng)
1)對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。
2)染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時(shí)間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。
3)為了保證熒光染色的正確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
① 標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
② 特異性對照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
③ 陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。
4)一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降?！ ?/p>
2.間接免疫熒光法測抗體
（1）基本原理
染色程序分為兩步，第一步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。
（2）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋 。
搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（3）實(shí)驗(yàn)步驟
1)滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。
2)滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
3)取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩 。
4)取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。
5)將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
6)重復(fù)操作3。
7)取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
8)熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。
（4）注意事項(xiàng)
1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過長 ，會(huì)使熒光減弱。
2)每次試驗(yàn)時(shí) ，需設(shè)置以下三種對照：
① 陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物
② 陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物
③ 熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物
3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。
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