堿性磷酸酶
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生物化學(xué)特征
堿性磷酸酶名字
alkaline phosphatase (ALP 或 AKP)
現(xiàn)多用ALP
系統(tǒng)名phosphate-monoester phosphohydrolase (alkaline optimum)
其他名稱還有alkaline phosphomonoesterase; phosphomonoesterase; glycerophosphatase; alkaline phosphohydrolase; alkaline phenyl phosphatase; orthophosphoric-monoester phosphohydrolase (alkaline optimum);basic phosphatase
CAS 號(hào): 9001-78-9
堿性磷酸酶
屬于同源二聚體蛋白，分子量為56KDa。每個(gè)單體由449個(gè)氨基酸組成，完整的AKP分子呈現(xiàn)典型的α/β的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，同時(shí)每個(gè)單體均具有一個(gè)活性中心，活性中心區(qū)域由Asp101-Ser102-Ala103三連體、Arg166、水分子、三個(gè)金屬離子及其配體氨基酸組成。AKP被phoA 基因編碼，與很多分泌蛋白一樣，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成氨基末端帶有信號(hào)肽的單體前體，信號(hào)肽引導(dǎo)前體跨內(nèi)膜運(yùn)輸后被切除，同源二聚體形成。
堿性磷酸酶是一種能夠?qū)?duì)應(yīng)底物去磷酸化的酶，即通過(guò)水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等。而該脫去磷酸基團(tuán)的過(guò)程被稱為去磷酸化或脫磷酸化。堿性磷酸酶是磷酸酶的一種，磷酸酶的作用與激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，將磷酸基團(tuán)加到對(duì)應(yīng)底物分子上。堿性磷酸酶在堿性環(huán)境有最大活力，對(duì)來(lái)源于細(xì)菌中的ALP來(lái)說(shuō)，其最適pH是8.0，而對(duì)來(lái)源于牛的ALP則是8.5。
ALP是一種含鋅的糖蛋白，在堿性環(huán)境中（最適Ph為10左右）可以水解各種天然及人工合成的磷酸單酯化合物底物?！ ?/p>
人體內(nèi)的來(lái)源
人體內(nèi)情況
堿性磷酸酶是廣泛分布于人體各臟器器官中，其中以肝臟為最多其次為腎臟，骨骼、腸、和胎盤等組織,。這種酶能催化核酸分子脫掉5’磷酸基團(tuán)，從而使DNA或RNA片段的5’-P末端轉(zhuǎn)換成5’-OH末端。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。目前已發(fā)現(xiàn)有 AKP1 、 AKP2 、 AKP3 、 AKP4 、 AKP5 與 AKP6 六種同功酶。其中第 1 、 2 、 6 種均來(lái)自肝臟，第 3 種來(lái)自骨細(xì)胞，第 4 種產(chǎn)生于胎盤及癌細(xì)胞，而第 5 種則來(lái)自小腸絨毛上皮與成纖維細(xì)胞。 血清中的ALP主要來(lái)自肝臟和骨骼。生長(zhǎng)期兒童血清內(nèi)的大多數(shù)來(lái)自成骨細(xì)胞和生長(zhǎng)中的骨軟骨細(xì)胞，少量來(lái)自肝。尿中的直接來(lái)自于腎小管細(xì)胞，并非來(lái)源于血液。
堿性磷酸酶主要用于阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查。患這些疾病時(shí)，肝細(xì)胞過(guò)度制造ALP，經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)入血液，同時(shí)由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清堿性磷酸酶明顯升高。但由于骨組織中此酶亦很活躍。因此，孕婦、骨折愈合期、骨軟化癥。佝僂病、骨細(xì)胞癌、骨質(zhì)疏松、肝膿腫、肝結(jié)核、肝硬變、白血病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)時(shí)，血清堿性磷酸酶亦可升高，應(yīng)加以鑒別?！ ?/p>
研究應(yīng)用
堿性磷酸酶也是目前免疫診斷試劑產(chǎn)品最常用的標(biāo)記酶之一。與辣根過(guò)氧化物酶（HRP)相比，ALP用作標(biāo)記酶的優(yōu)點(diǎn)是，穩(wěn)定性高、靈敏度高，缺點(diǎn)是成本高，標(biāo)記困難。
在研究中最常用的ALP如下：
◇細(xì)菌堿性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase (BAP), 來(lái)源：Escherichia coli C4 ；
◇ Shrimp alkaline phosphatase (SAP), 來(lái)源：一種北極蝦 (Pandalus borealis) ;
◇ 小牛腸堿性磷酸酶Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP);
◇ 胎盤堿性磷酸酶Placental alkaline phosphatase (PALP)和分泌性堿性磷酸酶the secreted alkaline phosphatase (SEAP)，后者是前者的C末端短缺版——與PALP相比，SEAP沒(méi)有PALP的C末端最后24個(gè)氨基酸(這24個(gè)氨基酸構(gòu)成了與糖基化磷脂酰肌醇靶向錨定的區(qū)域)
ALP主要應(yīng)用于分子生物學(xué)和酶免分析中：
★分子生物學(xué)中主要用作核酸的去磷酸化。因?yàn)镈NA通常會(huì)在5'端結(jié)合磷酸基團(tuán)，用ALP去磷酸化能防止DNA分子5'端與3'端連接，從而在后續(xù)步驟準(zhǔn)備好之前讓DNA分子抑制處于線性化狀態(tài);同樣，通過(guò)去磷酸化可用作放射標(biāo)記示蹤。通常用作這些目的用的最多的是Shrimp alkaline phosphatase (SAP)，因?yàn)樵诜磻?yīng)完成之后它是最容易滅活的。
★酶免分析中應(yīng)用最多的是ELISA，以競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)小分子抗原為例，抗體先與固相載體結(jié)合，然后讓待測(cè)樣品與事先經(jīng)ALP標(biāo)記過(guò)的該抗原競(jìng)爭(zhēng)地與抗體結(jié)合，洗去未反應(yīng)的過(guò)量ALP-抗原，加入顯色底物。則可以通過(guò)與按梯度濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)品繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比從而知道待測(cè)樣品中抗原的濃度。ELISA中用的比較多的是 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，底物為OPD， 深桔黃色 ，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm；TMB， 藍(lán)綠色，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm 堿性磷酸酶，底物為PNPP（對(duì)－消基苯磷酸酯）， 黃色 ，檢測(cè)波長(zhǎng)405nm
★目前工業(yè)上一個(gè)普遍的應(yīng)用是作為檢驗(yàn)牛奶的巴斯的滅菌的標(biāo)志：被巴斯德過(guò)高溫滅菌的分子會(huì)被滅活，向其中和未巴斯滅菌的牛奶中加入ALP的底物，2分鐘后未滅菌的樣品應(yīng)該顯黃色，如果待測(cè)樣品(指被巴斯滅菌過(guò)的牛奶)也能呈現(xiàn)相同顏色，則說(shuō)明巴斯滅菌溫度未過(guò)度。當(dāng)然總有例外，因?yàn)橛猩贁?shù)細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生耐熱的ALP。
測(cè)定方法
有很多種，我國(guó)曾應(yīng)用較廣的為磷酸苯二鈉比色法，但現(xiàn)在應(yīng)用較多的是連續(xù)檢測(cè)法。
正常范圍
正常范圍（連續(xù)監(jiān)測(cè)法）
女性，1-12歲小于500U/L；大于15歲，40-150U/L；
男性，1-12歲小于500U/L；12-15歲，小于750U/L；大于15歲，40-150U/L。
高值可能說(shuō)明有單管阻塞現(xiàn)象；低值更多出現(xiàn)于兒童和孕婦身上。高值表明有可能發(fā)生了活性骨沉積(這個(gè)可能譯的不準(zhǔn)，請(qǐng)指正，原文為active bone deposition)，因?yàn)锳LP是成骨細(xì)胞活動(dòng)(造骨)的副產(chǎn)物(例如在佩吉氏斯癥［畸形性骨炎］的案例中)。
一般來(lái)說(shuō)，低值要比高值少見(jiàn)。
臨床意義
臨床上測(cè)定ALP主要用于骨骼 、肝膽系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷，尤其是黃疸的鑒別診斷。對(duì)于不明原因的高ALP血清水平，可測(cè)定同工酶以協(xié)助明確其器官來(lái)源。
1．生理性增高：兒童在生理性的骨骼發(fā)育期，堿性磷酸酶活力可比正常人高1～2倍。處于生長(zhǎng)期的青少年，以及孕婦和進(jìn)食脂肪含量高的食物后均可以升高。
2．病理性升高：
(1)骨骼疾病如佝僂病、軟骨病、骨惡性腫瘤、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移等；
(2)肝膽疾病如肝外膽道阻塞、肝癌、肝硬化、毛細(xì)膽管性肝炎等；
(3)其他疾病如甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)。
3．病理性降低：見(jiàn)于重癥慢性腎炎、兒童甲狀腺機(jī)能不全、貧血等。
抑制作用
除來(lái)源于胎盤外所有哺乳動(dòng)物的ALP同工酶都能被高精氨酸所抑制；而除來(lái)源于腸和胎盤外所有的ALP同工酶都能被左旋咪唑所抑制；而除了來(lái)源于胎盤的ALP(PALP和SEAP)外，幾乎所有的ALP都能在65℃2小時(shí)即被滅活。
單乙醇胺對(duì)堿性磷酸酶有溫度依賴的抑制作用；
較高濃度的無(wú)機(jī)磷可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制堿性磷酸酶的活性；
EDTA通過(guò)絡(luò)合堿性磷酸酶而導(dǎo)致該酶活性中心微環(huán)境構(gòu)象發(fā)生變化，從而不可逆地抑制堿性磷酸酶的活性；
其他的抑制劑還有聯(lián)苯胺(競(jìng)爭(zhēng)性)、L-苯丙氨酸和丹酰-L-苯丙氨酸(反競(jìng)爭(zhēng)性)、含氮雜環(huán)氧釩配合物(選擇性)、五氯酚(對(duì)人胎盤堿性磷酸酶反競(jìng)爭(zhēng)性抑制)等。
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