酶聯(lián)免疫吸附試驗
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酶聯(lián)免疫吸附試驗 (Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA) 利用抗原抗體之間專一性鍵結(jié)之特性，對檢體進行檢測；由于結(jié)合于固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性，因此設(shè)計其鍵結(jié)機制后，配合酵素呈色反應(yīng)，即可顯示特定抗原或抗體是否存在，并可利用呈色之深淺進行定量分析。
目錄 |
歷史與展望
二十幾年來，免疫學分析方法發(fā)展很快，特別是在使用標記了的抗原和抗體的分析技術(shù)以后，使原來許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技術(shù)之后，在70年代初期又建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技術(shù)。由于酶的高效生物催化作用，一個酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相繼分別報道后，現(xiàn)已引起廣泛重視。
ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴大，可概括四個方面：
- 免疫酶染色各種細胞內(nèi)成份的定位。
- 研究抗酶抗體的合成。
- 顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。
- 定量檢測體液中抗原或抗體成份。
基本原理
ELISA的基本原理有三條：
（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學活性；
（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學和酶學活性；
（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。
種類
由于ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因為此種放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一種既敏感又特異的方法。常用的ELISA有以下兩個方面。
測定抗原
主要有：
1、競爭法（Competition method）：本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個過程，稱為包被（Coated），也可叫做致敏。經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測定的未知抗原的量。這種方法所測定的抗原只要有一個結(jié)合部位即可，因此，對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。該法的優(yōu)點是快，因為只有一個保溫洗滌過程。但需用較多量的酶標記抗原為其缺點。
2、雙抗體夾心法：本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。
測定抗體
所用的方法稱為間接法，也是目前最常用的方法。間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測抗體之標本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標記抗抗體，(對人的標本來說即加酶標抗人球蛋白IgG、IgM)，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測抗體的量，其結(jié)果可用目測或用分光光度計定量測定，本法用不同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲病以及其他疾病的血清學診斷。如用酶標記抗人IgM,則可用于早期診斷。
應(yīng)用
ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地擴大，原則上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。
酶免疫試驗（EIA）結(jié)合光學顯微鏡或電子顯微鏡可進行抗原定位與結(jié)構(gòu)的研究，用酶標記抗原或抗體結(jié)合免疫擴散及免疫電泳可提高試驗的敏感性。在實際應(yīng)用方面可作疾病的臨床診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上的植物病害的診斷檢定等。因此，它和生物化學、免疫學、微生物學、藥理學、流行病學及傳染病學等方面密切相關(guān)。
檢查抗原和半抗原方面：在內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當，在血液學方面可用于檢查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細胞抗原及結(jié)合球蛋白（Hapto Globin）等，在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），對前者的敏感性已達到與放射免疫試驗相當?shù)乃?，但對CEA檢查的敏感性較低，目前尚不能用于常規(guī)診斷,在傳染病的診斷方面正在日益擴大，其中最滿意的是用于檢查乙型肝炎表面抗原。國內(nèi)外已有ELISA檢測的商品供應(yīng)。
尚有用于檢查霍亂弧菌、大腸肝菌、綠膿桿菌和破傷風梭菌毒素；腦膜炎球菌及淋球菌抗原；檢查免疫抑制病人中常見的白色念殊菌抗原，檢查病人或病獸的糞便中的輪狀病毒，自病人標本中檢查甲肝病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨細胞病毒等。還可用于植物組織漿液中檢查植物病毒。此外尚試用于測鉤體抗原及血吸蟲病的循環(huán)抗原等。在免疫化學方面可用于檢測白蛋白，免疫球蛋白的各種組份，也可用于檢測補體成份，如：ciq，還能用于檢測蛇毒。
檢查抗體方面：用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對多種傳染病和寄生蟲病的血清學診斷，亦開始廣泛用于現(xiàn)場流行病學調(diào)查。在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學診斷，這對人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。在病原微生物方面已用于檢查鏈球菌、沙門氏菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等的抗體，還可用于破傷風抗毒素和霍亂弧菌抗毒素的測定以及檢測斑疹傷寒立克次氏體感染后的抗體，可作診斷。對立克次氏體還可用以鑒別密切有關(guān)的種屬。也有用于檢查鸚鵡熱衣原體抗體的報導(dǎo)。試用于病毒抗體檢查報告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹、風疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、狂犬病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其敏感性都超過目前常用的檢查方法。此外，還可用于鑒定病毒型別，例如皰疹病毒。如能進一步改進方法用于檢查特異性IgM，可以作為早期診斷以及了解體內(nèi)有關(guān)抗原的清除情況。在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測定以及對過敏的診斷，例如檢測各種過敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等。在衛(wèi)生學方面，可用于檢測食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。
局限性
從以上的簡單介紹中可以看出，ELISA法由于本身所具備的優(yōu)越性，是一項很有發(fā)展前途的血清學診斷方法，而且應(yīng)用的領(lǐng)域也越來越廣泛。但是我們認為ELISA不是萬應(yīng)良方，用它來代替一切，這是不當?shù)?。因為ELISA法還有局限性：
- 由于ELISA所用的抗原大部分還是混合的可溶性抗原，所以對同一微生物寄生蟲或其他物質(zhì)不同部位的抗原還沒有分開。
- 內(nèi)源性過氧化酶的普遍存在，如人腦組織中，呼吸道分泌物的炎癥細胞中及某些病毒的組織培養(yǎng)中均有內(nèi)源性過氧化物酶的活力，常不易除去，如果用某些方法除去時，則病毒的抗原性亦受到破壞，對于用ELISA檢測不利。
- 對ELISA法的非特異性評價的資料尚不夠完善，因此，對出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)的時候，往往不易解釋。
- 固相載體的質(zhì)量常不統(tǒng)一，主要是原料及制備工藝還不一致，致使不同批號的固相載體有時本底值較高，有時吸附性能很差，影響試驗結(jié)果。
- 試劑不統(tǒng)一，現(xiàn)在處于“八仙過海，各顯神通”，標準還不能統(tǒng)一。
參看
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酶聯(lián)免疫吸附試驗及其應(yīng)用.鮑行豪
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