沙門氏菌
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沙門氏菌（Salmonella）沙門氏菌病的病原體。屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。已發(fā)現(xiàn)的近一千種(或菌株)。按其抗原成分，可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組。其中與人體疾病有關(guān)的主要有甲組的副傷寒甲桿菌，乙組的副傷寒乙桿菌和鼠傷寒桿菌，丙組的副傷寒丙桿菌和豬霍亂桿菌，丁組的傷寒桿菌和腸炎桿菌等。除傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌和副傷寒乙桿菌引起人類的疾病外，大多數(shù)僅能目引起家畜、鼠類和禽類等動(dòng)物的疾病，但有時(shí)也可污染人類的食物而引起食物中毒?！ ?/p>
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沙門氏菌基本介紹
沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。它們除可感染人外，還可感染很多動(dòng)物包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類及昆蟲。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾，
它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。
蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，感染主要取決于沙門氏菌的血清型和食用者的身體狀況，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個(gè)體。根據(jù)國際慣例，要求對(duì)易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行分類管理，以使大多數(shù)食物不含沙門氏菌，從而有效預(yù)防沙門氏菌病。為此，人們?cè)谔剿魃抽T氏菌檢測方法的過程中，作出了不懈的努力，現(xiàn)將有關(guān)進(jìn)展報(bào)告如下，并介紹兩種快速檢測沙門氏菌的試劑盒?！ ?/p>
沙門氏菌抗原構(gòu)造與分類
o抗原
為脂多糖，性質(zhì)穩(wěn)定。能耐100℃達(dá)數(shù)小時(shí)，不被乙醇或0.1%石炭酸破壞。決定o型原特異性的是脂多糖中的多糖側(cè)鏈部分，以1、2、3等阿拉伯?dāng)?shù)字表示。例如乙型副傷寒桿菌有4、5、12三個(gè)。鼠傷寒桿菌有1、4、5、12四個(gè)；豬霍亂桿菌有6、7二個(gè)。其中有些o抗原是幾種菌所共有，如4、5為乙型副傷寒桿菌和鼠傷寒桿菌共有，將具有共同o抗原沙門氏菌歸為一組，這樣可將沙門桿氏菌屬分為a～z、o51～o63、o65～o67共有42組。我國已發(fā)現(xiàn)26個(gè)菌組、161個(gè)血清型。使人類致病的沙門氏桿菌大多屬于a～e組。o抗原刺激機(jī)體主要產(chǎn)生lgm抗體。
h抗原
為蛋白質(zhì)，對(duì)熱不穩(wěn)定，60℃經(jīng)15分鐘或乙醇處理被破壞。具有鞭毛的細(xì)菌經(jīng)甲醇液固定后，其o抗原全部被h抗原遮蓋，而不能與相應(yīng)抗o抗體反應(yīng)。h抗原的特異性取決于多肽鏈上氨基酸的排列順序和空間構(gòu)型。
沙門氏桿菌的h抗原有兩種，稱為第1相和第2相。第1相特異性高，又稱特異相，用a、b、c等表示，第2相特異性低，為數(shù)種沙門氏桿菌所共有，也稱非特異相，用1、2、3等表示。具有第1相和第2相h抗原的細(xì)菌稱為雙相菌，僅有一相者稱單相菌。每一組沙門氏桿菌根據(jù)h抗原不同，可進(jìn)一步分種或型。h抗原刺激機(jī)體主要產(chǎn)生lgg抗體。
vi抗原
因與毒力有關(guān)而命名為vi抗原。由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸組成。不穩(wěn)定，經(jīng)60℃加熱、石碳酸處理或人工傳代培養(yǎng)易破壞或丟失。新從患者標(biāo)本中分離出的傷寒桿菌、丙型副傷寒桿菌等有此抗原。vi抗原存在于細(xì)菌表面，可阻止o抗原與其相應(yīng)抗體的反應(yīng)。vi抗原的抗原性弱。當(dāng)體內(nèi)菌存在時(shí)可產(chǎn)生一定量抗體；細(xì)菌被清除后，抗體也隨之消失。故測定vi抗體有助于對(duì)傷寒帶菌者的檢出。
沙門氏菌在感染細(xì)胞時(shí)采取嚴(yán)格的“三步走”戰(zhàn)略。首先，在自己的表面形成一個(gè)針狀突起，以此建立和目標(biāo)細(xì)胞之間的接觸，然后，一些專門的蛋白質(zhì)會(huì)通過這個(gè)突起抵達(dá)目標(biāo)細(xì)胞，破壞目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜，打出一個(gè)“洞”，最后，沙門氏菌細(xì)胞通過這個(gè)“洞口”向目標(biāo)細(xì)胞釋放真正具有毒性的蛋白質(zhì)。
傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌
兩種生物如果在生物分類上被歸入一個(gè)種，想必是非常親近的了。傷寒沙門氏菌Salmonella Typhi和鼠傷寒沙門氏菌Salmonella Typhimurium這兩個(gè)名字，看起來也夠像的。不過，它們的行為大不相同，基因序列也沒有那么像。
傷寒沙門氏菌只感染人類，損害肝、脾和骨髓，每年導(dǎo)致1600萬人生病，60萬人死掉，由于越來越多菌株具有抗藥性，情況可能變得更糟。鼠傷寒沙門氏菌對(duì)生活環(huán)境不那么挑剔，幾乎可感染一切地上走的或爬的活物，在人類身上造成的癥狀一般是食物中毒（愛吃生雞蛋的人小心），聽起來好像沒有傷寒那么可怕，但一些科學(xué)家認(rèn)為它的威脅更大，由此造成的食物中毒事件實(shí)際發(fā)生數(shù)目比報(bào)告數(shù)目可能多出30倍，每年有上億人感染，死亡人數(shù)比傷寒沙門氏菌多出一倍，主要是嬰幼兒和老人。
劍橋SANGER中心——還是這個(gè)中心，連項(xiàng)目的領(lǐng)導(dǎo)者也跟上面的鼠疫桿菌是同一人——從越南弄來了一種能夠抵抗多種抗生素的傷寒沙門氏菌菌株。測序發(fā)現(xiàn)，它的基因組里有200多個(gè)假基因， 它們一度起過作用，但在病菌適應(yīng)人體生活環(huán)境的過程中被拋棄了——而這也可能把它逼上了進(jìn)化的死角?？茖W(xué)家希望，這種單一的口味會(huì)使它比較容易對(duì)付，只要阻斷它感染人類的途徑，就有希望根除這種疾病。在此之前，根據(jù)基因組也可以設(shè)計(jì)出更好的疫苗和診斷方法。由于傷寒的癥與瘧疾和登革熱等病相似，很容易搞混。
危害及影響
夏天正是新鮮蔬果搶閘上市的時(shí)節(jié)，而在大洋彼岸的美國，這個(gè)夏天卻有不少人因生吃西紅柿被“絆倒”了——據(jù)最近統(tǒng)計(jì)，目前，美國已有30個(gè)州幾百人因生食了從墨西哥進(jìn)口的帶有沙門氏菌的新鮮西紅柿而中毒，患者中至少48人因病情嚴(yán)重住院，其中1人死亡，而“生食療法”被視為一種健康的時(shí)尚，如今聽說生吃蔬果也會(huì)中毒，不少人十分著急：到底該如何預(yù)防？對(duì)此，專家指出，并不是所有的蔬果都越鮮吃越好，其實(shí)生吃蔬果有不少講究，有些菜涼拌前一定要用開水焯一下，徹底除塵去蟲更衛(wèi)生。
疫情：美國人生吃西紅柿“中毒”
生吃西紅柿等新鮮的時(shí)蔬水果是再平常不過的事了，然而，在美國中西部和南部30個(gè)州，近日卻有數(shù)百人因生食了從超市或是餐館購買的新鮮西紅柿而出現(xiàn)發(fā)燒、腹瀉、腹痛等癥狀，這些西紅柿進(jìn)口自墨西哥。有幾十人因病情嚴(yán)重需住院，甚至已有重癥病人死亡。美國疾控中心通過檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吃過這些西紅柿的患者檢查中都發(fā)現(xiàn)了沙門氏菌，看來，這是一起嚴(yán)重的沙門氏菌病疫情。
沙門氏菌是美國食物中毒致死的主要原因。美國人對(duì)這種病菌一點(diǎn)都不陌生，每年全國大約報(bào)告40000例沙門氏菌感染病例。但實(shí)際的感染人數(shù)可能要達(dá)20倍以上，因?yàn)樵S多輕型病人可能未確診，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年大約有1000人死于急性沙門氏菌感染。但是，以前各州爆發(fā)的疫情幾乎都與人們吃了染上沙門氏菌的肉類、蛋類、乳類有關(guān)，但迄今為止，很少聽說吃蔬果大面積受沙門氏菌污染甚至在人群中引發(fā)大疫情的。對(duì)此，周福生教授解釋說，這可能是西紅柿在生長的過程中，由于空氣中紫外線不夠強(qiáng)烈，植物在灌溉過程或因土壤中含有沙門氏菌，這樣才使西紅柿的表皮上沾染了沙門氏菌，加上不少人有生食西紅柿的習(xí)慣，如果沒有清洗干凈，就完全有可能發(fā)生沙門氏菌感染。不光是食用西紅柿，其他瓜果蔬菜也一樣。
美國SIDNEY KIMMEL癌癥中心的科學(xué)家對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)它的假基因比傷寒沙門氏菌少得多，只有40多個(gè)。此外，兩種病菌還各自擁有幾百個(gè)對(duì)方所不具備的基因。對(duì)于同屬一種的兩種生物來說，這種差異足夠讓人驚詫。已知的腸道沙門氏菌有2000種之多，有幾種已經(jīng)在測序中，屆時(shí)大家彼此對(duì)照起來看，就更有意思了?！ ?/p>
沙門氏菌檢測方法
自19世紀(jì)后期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來，檢測方法學(xué)都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎(chǔ)上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的。但至少有三個(gè)因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上。第一，通常，沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質(zhì)會(huì)干擾病原的檢測，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個(gè)很高的水平，從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱“致傷”。這就形成了一個(gè)具有不同生長特性的細(xì)菌群。這種現(xiàn)象對(duì)那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來說有很大影響，因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門氏菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，專門針對(duì)以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7天才能完成。因此，在需要及時(shí)、快速評(píng)價(jià)食品中微生物的安全性時(shí)，通常不被采用。隨著DNA和抗體技術(shù)的發(fā)展，近10～15年間發(fā)展了無數(shù)改進(jìn)的方法，其中許多可以在48h內(nèi)檢出沙門氏菌，這些方法通稱為快速檢測。
1、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法
用于沙門氏菌分析的傳統(tǒng)方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養(yǎng)方法總體可分4個(gè)不同階段或步驟。第一步(預(yù)增菌)，將樣品加到一種高營養(yǎng)、無選擇性的培養(yǎng)基中，溫度37℃，使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇及使所有微生物生長。雖然緩沖胨水被建議常規(guī)使用(由于其可保持溶液pH值穩(wěn)定)，但對(duì)培養(yǎng)基的選擇仍存有爭論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門氏菌生長而使肉湯中同時(shí)存在的微生物數(shù)量減少，與預(yù)增菌培養(yǎng)基相似，對(duì)選擇性培養(yǎng)基的選擇，也存在許多不同的觀點(diǎn)。目前應(yīng)用的主要有如下3種類型：連四硫基鹽肉湯(Tetrathionatebroth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養(yǎng)基。由于沒有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂脙煞N培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗(yàn)。第三步是分離步驟，即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后對(duì)平板上肉眼可見的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn)，并對(duì)該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測，以作出鑒定。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測法全過程需時(shí)至少4～7天，才能得出明確的診斷結(jié)果。
2、以抗體為基礎(chǔ)的檢測方法
利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性，來進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型，已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史。細(xì)菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。已經(jīng)建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測方法有許多種，大致可分為以酶標(biāo)抗體(ELISA)，熒光抗體染色(免疫熒光法)，同位素標(biāo)記抗體(放射免疫試驗(yàn))為基礎(chǔ)的方法及其它多種以抗體為基礎(chǔ)，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散及免疫色譜技術(shù)的方法。但常規(guī)中最廣泛采用的是以雙位點(diǎn)ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎(chǔ)的方法。此法改進(jìn)后用有放射活性的同位素替代標(biāo)記抗體，概括地說，是指以固定在固體基質(zhì)上的“捕捉”抗體來捕捉目標(biāo)抗原，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的成分，加入第二種酶標(biāo)抗體，此者結(jié)合在捕捉到的抗原的不同位點(diǎn)上，第二次洗滌后加入酶作用基質(zhì)，并令其與顏色成分反應(yīng)，然后用分光光度法即很容易檢測到目標(biāo)抗原。采用微量滴定板作為固態(tài)基質(zhì)使反應(yīng)形式標(biāo)準(zhǔn)化，并促成其自動(dòng)化。
黎兆滾等人首次在國內(nèi)口岸系統(tǒng)應(yīng)用微量板ELISA法(Salmonelletest1)對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物產(chǎn)品(魚粉、肉骨粉等)進(jìn)行沙門氏菌檢測。該法采用預(yù)先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板，加入經(jīng)增菌處理的樣品，反應(yīng)后再加入一定的指示劑，作用畢后用酶標(biāo)儀測定OD值來判定結(jié)果。食物樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)脑鼍幚恚部捎么朔ㄟM(jìn)行沙門氏菌檢測。ELISA法檢出沙門氏菌的極限范圍在105～106個(gè)細(xì)胞/ml，因此，要得出可靠的結(jié)果，食物樣品首先必需進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進(jìn)行后增菌，以促進(jìn)鞭毛發(fā)育?？偟膩碚f，標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品的制備，約需要經(jīng)過40～48h的孵育才能完成。黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)樣品制備過程分步，共耗時(shí)24h：①選用營養(yǎng)肉湯進(jìn)行預(yù)增菌(6h)，使“致傷”、冷凍的沙門氏菌復(fù)蘇。②使用選擇性培養(yǎng)基RV進(jìn)行增菌(14h)，使沙門氏菌大量繁殖，同時(shí)抑制其它雜菌生長。③使用營養(yǎng)肉湯(蛋白胨水)進(jìn)行后增菌(4h)，使沙門氏菌的數(shù)量大大增加。比上述標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品制備過程縮短了一半的時(shí)間。ELISA方法本身，則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時(shí)間，90min是孵育時(shí)間)。相比之下，黎兆滾等人的方法可在27h內(nèi)完成，比上述方法縮短了一半的時(shí)間，頗值得推廣應(yīng)用。最新式的沙門氏菌免疫學(xué)檢測法，利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎(chǔ)。幾滴樣品加到卡片上，結(jié)果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由于無需要特殊設(shè)備，很適合小型實(shí)驗(yàn)室使用。盡管卡片檢測法與ELISA法一樣需要對(duì)樣品進(jìn)行增菌處理，但它(卡片法)本身通常需時(shí)不超過10min，如果采用黎兆滾等人的樣品制備法，則可使操作時(shí)間更為縮短。
3、以核酸為基礎(chǔ)的方法
細(xì)胞核酸DNA和RNA是唯一一類可以攜帶信息的大分子。由于所有的細(xì)胞都含有這種分子，可以利用它作為檢測的標(biāo)靶。標(biāo)靶通常是一個(gè)特異性核酸序列，它可通過以補(bǔ)體核酸分子作為探針來檢出。與免疫學(xué)方法相似，探針也需要加附適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，如放射性同位素、酶或發(fā)光的標(biāo)識(shí)物。Fitts等人在食品沙門氏菌檢測中引入了第一代DNA—RNA雜交技術(shù)，此法應(yīng)用的探針含有用放射性同位素標(biāo)記的傷寒沙門氏菌DNA片段，其敏感性高，經(jīng)大約48h的增菌步驟后，檢測極限可達(dá)108個(gè)細(xì)菌/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在專門的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，此方法的優(yōu)點(diǎn)都被抵消了。為此，以核酸雜交為基礎(chǔ)的第二代技術(shù)—比色計(jì)目前已發(fā)展起來。這種方法依賴于沙門氏菌核糖體RNA(rRNA)—核糖體發(fā)育過程中儲(chǔ)存的核酸成分的檢測。核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器的一部分，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中存在5000～20000個(gè)復(fù)制體，而相比之下染色體DNA復(fù)制體僅2～10個(gè)。這種天然富含rRNA標(biāo)靶序列的情況使得用無輻射計(jì)檢測成為可能，同時(shí)又保持了與放射性同位素方法相當(dāng)或更高的敏感性。其另一優(yōu)點(diǎn)是由于rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈)，雜交前無需經(jīng)過變性步驟。要得到陽性結(jié)果，此法需要105個(gè)靶細(xì)胞/ml，因此對(duì)沙門氏菌檢測來說，需要進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌，總共約50h。rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法(酶聯(lián)免疫檢測法)更耗時(shí)，但二者成本相近。食品細(xì)菌檢測法的最新進(jìn)展是在化學(xué)擴(kuò)增體系方面的發(fā)展，即聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，用該體系可對(duì)制備好的樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA擴(kuò)增，以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測。用于檢測沙門氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業(yè)已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動(dòng)化，且必需經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測反應(yīng)的某些成分。一個(gè)完整的以PCR為基礎(chǔ)的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵銷了其高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但這種方法對(duì)那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌“致傷”嚴(yán)重難以復(fù)蘇而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效。
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