單克隆抗體技術(shù)
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單克隆抗體技術(shù)(monoclonal antibody technology)，20世紀后期免疫學技術(shù)的重大突破，應(yīng)用B細胞雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體(McAb)。 B細胞雜交瘤是免疫的小鼠脾細胞 （B淋巴細胞）與小鼠骨髓瘤（一種漿細胞瘤，漿細胞是B淋巴細胞系的終末形式）細胞融合而成的雜交細胞，其核內(nèi)含有雙親細胞的染色體，繼承了親代細胞的特征，它既具有瘤細胞在體外培養(yǎng)中迅速增殖的能力，又具備免疫脾細胞合成和分泌特異性抗體的特性。B細胞雜交瘤經(jīng)過單個細胞培養(yǎng)，可繁殖成為一個細胞系（稱為克隆或克隆系），這個過程稱為克隆化，而由一個克隆系產(chǎn)生的抗體稱單克隆抗體。這種抗體只能特異地與抗原分子上的一個抗原決定簇結(jié)合反應(yīng)，抗體成分均一，抗體的結(jié)構(gòu)、氨基酸順序、特異性等都是一致的，且在培養(yǎng)過程中只要不發(fā)生變異，不同時間內(nèi)分泌的抗體都能保持同樣的結(jié)構(gòu)和功能。因此，用這種技術(shù)可按人們的意愿生產(chǎn)大量很純的單克隆抗體，這些都是用普通血清學方法所不能達到的。這技術(shù)在醫(yī)學和生物學各個領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，并為臨床疾病的診斷、治療提供了新手段。帶有多個抗原決定簇的抗原分子注入動物體內(nèi)，被帶有相應(yīng)抗原決定簇受體的淋巴細胞所識別，它們活化、增殖，每一個 B細胞系分別分泌針對單個抗原決定簇的抗體分子。普通抗血清是含有這些抗體的混合物。而將免疫小鼠的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，經(jīng)過克隆化，所產(chǎn)生的抗體是高度純一的單克隆抗體。
目錄 |
B細胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)
先將免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞在融合劑的作用下融合。融合后加入含有飼養(yǎng)細胞及次黃嘌呤－氨基蝶呤－胸腺嘧啶核苷(HAT)的選擇培基中篩選雜交瘤，測定抗體活性，進行克隆化，篩選出能產(chǎn)生所需特異性和性質(zhì)的抗體的亞克隆，進行擴增培養(yǎng)或接種于同系小鼠的腹腔中，使其在動物體內(nèi)增殖，從而能獲得大量的單克隆抗體。
骨髓瘤細胞系的選擇與培養(yǎng)
目前常用的適于融合的骨髓瘤細胞系多來自BALB/C小鼠和 Lou系大鼠。小鼠骨髓瘤細胞早期是采用缺少 HGPRT或TK酶但可分泌免疫球蛋白(無抗體活性)的骨髓瘤細胞 X63-Ag8細胞株。用X63-Ag8與免疫脾細胞融合形成的雜交瘤細胞，具有能合成兩個親代免疫球蛋白重鏈和輕鏈的基因，因而產(chǎn)生特異性抗體機率低?，F(xiàn)多采用完全不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞株 （稱為不產(chǎn)生者）， 如SP2/O-Ag14、X63-Ag8.653 、FO等細胞系，這樣使雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白只含有免疫脾細胞的重鏈和輕鏈，從而大大提高了所產(chǎn)生特異性抗體的比率。
骨髓瘤細胞系長期連續(xù)培養(yǎng)，可能會產(chǎn)生抗 HAT的變種，即由缺陷HGPRT回復(fù)至能產(chǎn)生HGPRT的突變株，以致融合率下降。因此每隔3～6個月將骨髓瘤細胞置于含8-氮雜鳥嘌呤的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以除去回復(fù)突變的細胞。必要時對骨髓瘤細胞系進行再克隆，選擇質(zhì)量好的骨髓瘤亞克隆，并深凍一大批以供使用。用于融合的骨髓瘤細胞必須處于活躍的對數(shù)生長期。每隔2～3天應(yīng)換新的培養(yǎng)液繼續(xù)傳代一次，可以使用于融合的骨髓瘤細胞保持在對數(shù)生長期一周左右，細胞存活率在90～95％。
免疫的小鼠脾細胞
由于供融合的小鼠骨髓瘤細胞系均來自BALB/C小鼠，故多選用同系BALB/C小鼠進行免疫。以8～12周齡雌性鼠為宜。大鼠可產(chǎn)生大量抗體，融合時亦可選用大鼠作為免疫脾細胞的供體。經(jīng)特定抗原的免疫，小鼠脾臟中分泌特異性抗體的B細胞數(shù)量增加并分化、增殖為漿母細胞，這些細胞易與骨髓瘤細胞融合。
免疫程序與方法各實驗室不同，主要依抗原的性質(zhì)及動物對抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)的不同來設(shè)計免疫方案。一般說，可溶化蛋白抗原的免疫原性弱，而應(yīng)用佐劑加強免疫應(yīng)答反應(yīng)。初次免疫時將抗原與等量弗羅因德氏完全佐劑混合，腹腔或皮下注射。2～4周后以同量抗原加等量不完全弗羅因德氏佑劑腹腔注射。再過2～6周，在融合前3～4天，腹腔或靜脈注射不加佐劑的抗原作為加強免疫。完整的細胞免疫原性強，不需應(yīng)用佐劑。由于動物對抗原的免疫反應(yīng)可能有個體差異，最好一次免疫3～5只小鼠，選擇免疫反應(yīng)好的小鼠，取混合脾進行融合，亦可分別取一個小鼠的脾臟分別進行3～5個融合。
融合的骨髓瘤細胞與免疫脾細胞的比例可以是1:1～1:10。但若脾細胞濃度過高，融合后多數(shù)培養(yǎng)孔中有多個雜交瘤細胞生長，使克隆化難以進行。一般在微量的多孔培養(yǎng)板中，每孔加入的融合后細胞總數(shù)以2×105個為宜，但最高細胞密度不得超過106個/孔。
融合劑
兩種細胞間的自發(fā)性融合率很低，一般為10-6～10-7。 細胞融合劑聚乙二醇(PEG)可促進細胞融合。作用機理可能為使脂膜易于打開，通常用分子量1000～4000的50％PEG溶液， 在37℃和pH8～8.2，作用1～2分鐘效果最佳。有人認為PEG中加二甲亞砜作為融合劑，效果更好。
HAT選擇雜交瘤細胞
據(jù)報道用108個脾細胞與5×107個骨髓瘤細胞經(jīng)PEG作用融合后，能存活下來，形成穩(wěn)定雜交瘤的細胞數(shù)只不過100～200個，即以脾細胞計算為1/100萬或1/50萬，這樣培養(yǎng)物中未融合的骨髓瘤細胞的過度生長，將會干擾雜交瘤細胞的生存。為清除未融合的骨髓瘤細胞并且篩選出雜交瘤細胞，現(xiàn)普遍應(yīng)用HAT選擇培養(yǎng)基， 其中含有次黃嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶核苷。在 HAT培基中小鼠骨髓瘤細胞和脾細胞死亡，而雜交瘤細胞繁殖形成克隆。骨髓瘤細胞內(nèi)缺乏次黃嘌呤－鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)，不能利用培基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷，所以未融合的骨髓瘤細胞不能繁殖。而小鼠脾細胞雖有HGPRT和TK，但缺乏在組織培基中繁殖的能力，一般在兩周內(nèi)死亡。唯有骨髓瘤細胞和脾細胞融合形成的雜交瘤細胞，可以從小鼠脾細胞中獲得HGPRT和(或)TK，在HAT培養(yǎng)基中可通過核酸代謝旁路將次黃嘌呤合成嘌呤核苷酸和(或)將胸腺嘧啶核苷合成嘧啶核苷酸，進而合成DNA。因此雜交瘤細胞能在HAT培養(yǎng)基中繁殖成克隆。
飼養(yǎng)細胞
細胞溶合后，用 HAT培基選擇雜交瘤細胞時，由于骨髓瘤細胞和脾細胞大量死亡，單個或少數(shù)分散的雜交瘤細胞在低密度時不易存活，必需加入其他活細胞才能使之繁殖，這種被加入的活細胞叫做“飼養(yǎng)細胞”。常用的飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬細胞、小鼠脾細胞、小鼠或大鼠胸腺細胞、大鼠胚胎傳代纖維母細胞或經(jīng)過γ射線照射的人胚肺纖維母細胞等。通常多采用腹腔巨噬細胞。飼養(yǎng)細胞可與融合細胞同時加到培養(yǎng)孔中，或提前一天加到培養(yǎng)孔中，由不同品系小鼠或異種鼠取得的腹腔巨噬細胞均同樣有效。小鼠腹腔巨噬細胞在效能上有差異，最好每次融合也用2～3個以上的小鼠腹腔混合液。
陽性雜交瘤細胞的篩選
細胞融合后，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5～14天，即可在培養(yǎng)板孔中生長出雜交瘤細胞集落，此時便可測定抗體活性，對能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞，應(yīng)及早進行克隆化，以防因不產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞過度生長而丟失。另外，開始測定時由于分泌抗體陽性的雜交瘤細胞數(shù)尚少，可能測得抗體陰性，因此應(yīng)重復(fù)測定抗體活性2～3次，并在換液后3～4天進行，以便抗體積累。為盡早篩選出分泌抗體的雜交瘤細胞，需要用敏感、可靠、快速的方法測定，常用的有固相放射免疫測定法（RIA），酶免疫分析法(EIA)和免疫熒光法(IFA)等來檢測上清中的微量抗體。
①固相放射免疫測定法：原理是抗原結(jié)合到固相載體的表面，并保持其免疫活性。若待測標本中存在對此抗原的特異性抗體，就會同吸附在載體表面的抗原結(jié)合，然后與放射性核素125Ⅰ標記的第二抗體一起孵溫育，即可根據(jù)放射性強度，判讀有無相應(yīng)抗體的存在。本法敏感、簡便、準確，是目前篩選雜交瘤抗體最常用的方法。②酶免疫分析法:常用的是間接法，原理是用酶標記的第二抗體篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清中與抗原結(jié)合的抗體。此法的靈敏度和特異性與放射免疫測定法相似，但更簡便、快速，顯色反應(yīng)可用肉眼鑒別，且酶標試劑比較穩(wěn)定，是常用于初篩的方法。其缺點是某些細胞內(nèi)有內(nèi)源酶（如過氧化物酶），造成陰性對照本底較高，影響結(jié)果的判讀。此外，用該法不易查到對一小群細胞（細胞亞群）起反應(yīng)的抗體，此時可能將這種弱反映誤認為本底而漏掉。③免疫熒光法：采用熒光色素標記第二抗體，用間接免疫熒光染色法檢測活細胞膜表面抗原的抗體。本法已廣泛用于雜交瘤上清的篩選，能敏感地檢出抗細胞亞群表面抗原的抗體。免疫熒光法的全過程可在96孔聚乙烯微量板中進行，結(jié)合運用熒光激活細胞分類儀(FACS)分離熒光染色陽性和熒光染色陰性的細胞。本法是大量、快速篩選分泌抗體的雜交瘤的有效方法，但因價格昂貴而不易推廣。
雜交瘤細胞的克隆化
對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化，是獲得純的克隆系的一個重要步驟?？寺』瘯r應(yīng)注意：①融合后，一旦抗體檢測陽性，應(yīng)立即進行克隆化，同時雙份傳代，液氮凍存。②融合后，待骨髓瘤細胞確已死亡，可將 HAT培養(yǎng)液換以HT培養(yǎng)液，初次克隆化時加HT。③應(yīng)用有限稀釋法進行克隆化時必須經(jīng)過多次克?。ㄖ辽賰纱我陨希拍芑颈ＷC雜交瘤細胞為單克隆。④克隆化后的雜交瘤細胞，在培養(yǎng)過程中有時也會發(fā)生變異或染色體丟失，失去產(chǎn)生特異性抗體的能力，因此需定期測定培養(yǎng)上清中抗體的滴度。若抗體滴度下降或轉(zhuǎn)陰性時，則應(yīng)復(fù)蘇原始凍存的細胞管，進行培養(yǎng)檢測，必要時應(yīng)再克隆化和再凍存。
克隆化的方法為:①有限稀釋法。本法簡便易行，不需特殊設(shè)備，克隆效應(yīng)高，故最常用。方法是將測得抗體陽性的雜交瘤細胞作連續(xù)稀釋，稀釋至每毫升含10個細胞或更少，按定量分種于含有飼養(yǎng)細胞層的96孔培養(yǎng)板中，直接觀察孔里是否僅有一個細胞集落生長。在初次克隆化時，有的生長孔中只有一小部分有抗體活性，故應(yīng)將陽性克隆細胞移至24孔培養(yǎng)板擴大培養(yǎng)，并凍存一部分細胞，及時進行再克隆，以提高抗體陽性克隆的百分率和保證雜交瘤細胞的單克隆化。②軟瓊脂培養(yǎng)法。將適當濃度的雜交瘤細胞加至軟瓊脂培養(yǎng)基中，使由一個細胞增殖的克隆形成一個集落，將細胞集落擴大增殖培養(yǎng)，測定上清液的抗體活力，若為陽性就可選出所需抗體的克隆。本法的優(yōu)點是細胞融合后可直接進行克隆化，其缺點是克隆陽性率低，克隆化所需細胞濃度較高，因此所得單個細胞集落并不能絕對代表單個細胞克隆，常需進行再克隆化。
雜交瘤細胞的增殖
一旦雜交瘤細胞成功地克隆化，就可進行大量增殖以產(chǎn)生抗體。其方法有：①體外擴大培養(yǎng)法。剛獲得的雜交瘤細胞系不能耐受稀釋，因此培養(yǎng)物應(yīng)逐漸擴大。先將96孔培養(yǎng)板中抗體陽性的細胞作1:3或1:5稀釋，移至24孔培養(yǎng)板中孵育，再將其中抗體陽性的細胞擴大到25cm2培養(yǎng)瓶，然后轉(zhuǎn)種至75cm2的大培養(yǎng)瓶中大量增殖，一般細胞培養(yǎng)上清的抗體含量可達5～50μg/ml。②動物接種。將雜交瘤細胞接種于同系小鼠皮下或腹腔內(nèi)，約10天后，分別自血清或腹水中獲取較大量的抗體。
雜交瘤細胞的保存與復(fù)蘇
在雜交瘤培養(yǎng)過程中應(yīng)盡早地將抗體陽性的雜交瘤細胞凍存起來，放入液氮中(-196℃)保存，以防因體外傳代培養(yǎng)的細胞突變或因污染而丟失。
細胞復(fù)蘇的方法是：從液氮中取出細胞管，立即放在37℃水浴中化凍，并立即用毛細吸管吸出細胞。放入培養(yǎng)液中離心，將沉淀的細胞懸于培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
單克隆抗體的提純
單克隆抗體的保存
由腹水中獲得的抗體，經(jīng)離心去除細胞成分，再經(jīng)冷凍超速離心，取上清液加0.1％NaN3，少量分裝，冷凍于-70℃可保存幾年。 但應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則抗體失活，特別是IgM抗體。提純的單克隆抗體，冷凍干燥保存于2～8℃，取出時溶解后，保存于2～8℃，至少一個月內(nèi)可保持穩(wěn)定。腹水抗體也可冷凍干燥低溫(4℃)保存兩年，融化后放置4℃下保存一個月。短期使用的腹水抗體，4℃3～4 個月仍保持穩(wěn)定， 培養(yǎng)上清加0.1％NaN3，貯于-20℃，兩年不失活性。
單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用
單克隆抗體用于臨床診斷和治療，目前研究較多的是抗人 T細胞單克隆抗體，用以識別人T細胞表面的不同抗原決定簇，有OKT系統(tǒng)及Leu系統(tǒng)。T細胞，特別是免疫調(diào)節(jié)T細胞（Ti/h及Tc/s細胞）對于調(diào)控免疫應(yīng)答和維持免疫自穩(wěn)起著至關(guān)重要的作用，臨床上許多疾病的發(fā)生與免疫調(diào)節(jié)失常有關(guān)，因此，研究 T細胞在這些疾病中的變化，有助于探討病因和輔助診斷。各種免疫缺損病、腫瘤或感染性疾病都與免疫功能低下有關(guān)，而變態(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫性疾病等與免疫功能亢進有關(guān)。因此應(yīng)用 OKT系列單克隆抗體檢測這些疾病患者外周血中T細胞亞群及T4/T8比值的變化，對探討發(fā)病機理，及時診斷疾病及監(jiān)測病情發(fā)展有十分重要的意義。接受腎移植或骨髓移植的患者往往需應(yīng)用各種免疫抑制劑以控制排斥反應(yīng)， T細胞亞群的檢測有助于了解移植器官的排異和發(fā)展。
抗人 T細胞單克隆抗體可用以治療白血病、移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)和急性腎排斥等，目前尚處于摸索階段。
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