免疫熒光
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免疫熒光（immunofluorescence technic）
免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）。 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。
目錄 |
技術(shù)特點
該技術(shù)的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。
熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。
由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應(yīng)用。
原理
免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)?！ ?/p>
直接法
將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
間接法
如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷?！ ?/p>
技術(shù)分類
⑴ 熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))
抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法?！ ?/p>
⑵ 免疫熒光測定技術(shù)
抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法
（1）熒光物質(zhì)
1）熒光色素
許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
(1)異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：
有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
(2)四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：
最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。
(3)四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：
最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異?a href="/w/%E6%B0%B0%E5%9F%BA" title="氰基">氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。
（2）其他熒光物質(zhì)
1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。
2）鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3
螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于分辨熒光免疫測定?！ ?/p>
常見熒光素
1）FITC
2）RB200
3）TRITC
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE
6）其它
常見熒光素的特性
1）FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。
2）RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595~600nm，橘紅色熒光。
3）TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光 595nm，紅色熒光。
6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。
酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)
酶 底物 產(chǎn)物 激發(fā)光 發(fā)射光
Β-G MUG MU 360 450
AP MUP MU 360 450
HRP HPA 二聚體 317 414
（4）合適熒光素的選擇
1）具有與蛋白質(zhì)形成共價鍵的化學(xué)基團。
熒光素-N=C +NH-蛋白質(zhì) 熒光素-N-C-N-蛋白質(zhì)
‖ ︱ ︱‖ ︱
S H H S H
2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。
3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。
5）標(biāo)記方法簡單、快速。
6）安全無毒
免疫熒光技術(shù)的實驗步驟
1. 直接免疫熒光法測抗原
（1）基本原理
將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
（2）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（3）實驗步驟
① 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。
② 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時間（參考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時振蕩。
④ 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
⑤ 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：
（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。
（4）注意事項
1)對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。
2)染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時間可以從10 min到數(shù)小時，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。
3)為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
① 標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
② 特異性對照（抑制試驗）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
③ 陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
4)一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。
2.間接免疫熒光法測抗體
（1）基本原理
染色程序分為兩步，第一步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會和已結(jié)合抗原的抗體進一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。
（2）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋 。
搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（3）實驗步驟
1)滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。
2)滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
3)取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩 。
4)取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。
5)將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
6)重復(fù)操作3。
7)取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
8)熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。
（4）注意事項
1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。
2)每次試驗時 ，需設(shè)置以下三種對照：
① 陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物
② 陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物
③ 熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物
3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。
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