臨床生物化學(xué)/酶活性的濃度單位

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臨床生物化學(xué)

血清酶定量的檢測(cè)技術(shù)
- 測(cè)定酶活性濃度的兩大類方法

50年代以前酶活性濃度單位的命名混亂，常以方法提出者的姓氏來命名，例如淀粉酶的Somogyi單位，堿性磷酸酶的King單位等等，定義參差不齊，給臨床醫(yī)師帶來很大不便，尤其在建立“連續(xù)監(jiān)測(cè)法”測(cè)酶后，大量酶應(yīng)用于臨床，此混亂現(xiàn)象更為突出。1963年國(guó)際生化協(xié)會(huì)通過廣泛討論，提出一個(gè)國(guó)際單位定義來表示酶量的多少，即1分鐘能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物（μmolmin^－1）的酶量為一個(gè)國(guó)際單位，以IU表示之，由于意見不一致，至今尚未指定酶反應(yīng)溫度，而同一量的酶，在不同溫度時(shí)間為1分鐘所轉(zhuǎn)化底物的量將有明顯差異。為避免臨床上誤認(rèn)為只要是同一國(guó)際單位的酶量在國(guó)際上無論何處所測(cè)結(jié)果都應(yīng)一致，目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)工作者常省略國(guó)際二字（簡(jiǎn)寫也由IU改為U）。

臨床上測(cè)定的不是酶的絕對(duì)量而是濃度，1963年并未明確規(guī)定用ml或L表示體積。舊的文獻(xiàn)中可見到mU/ml，或U/L。目前在臨床化學(xué)中，幾乎都習(xí)慣用U/L來表示體液中酶活性濃度。我國(guó)由于近年來大量用自動(dòng)分析儀和連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)酶，已逐步不再使用各種古老單位，而使用U/L來表示酶活性濃度。

近年來國(guó)際上大力推廣SI制，我國(guó)已明確SI制為法定計(jì)量單位制，SI制中酶活性單位為Katal，即1秒中轉(zhuǎn)化1個(gè)摩爾底物（mol s^－1）的酶量，Katal對(duì)體液中酶量而言顯然過大，常用單位為ukatal或nkatal。

上述國(guó)際單位和katal間關(guān)系如下：

1U＝1μmol min^－1＝16.67nmol s^－1＝16.67nkatal

在我國(guó)不論實(shí)驗(yàn)室還是臨床醫(yī)師對(duì)katal都不太熟悉，如報(bào)告使用katal/L報(bào)告酶結(jié)果時(shí)，最好同時(shí)注明相應(yīng)的U/L。

（一）連續(xù)監(jiān)測(cè)法中酶活性濃度的計(jì)算

前面已提到連續(xù)監(jiān)測(cè)法優(yōu)點(diǎn)之一是計(jì)算方便，不需作標(biāo)準(zhǔn)曲線或標(biāo)準(zhǔn)管，用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)酶反應(yīng)過程時(shí)，很容易求出反應(yīng)體系每分鐘吸光度變化，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)可求出△A相當(dāng)測(cè)定物質(zhì)變化的微摩爾數(shù)，由于臨床醫(yī)師需要知道的是標(biāo)本中而不是反應(yīng)體系中酶的濃度，計(jì)算中要考慮標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，假如比色杯光徑不是1cm，則還應(yīng)考慮光徑不同對(duì)△A的影響，這樣整個(gè)計(jì)算公式應(yīng)為：

此中ε為摩爾（線性）吸光體系（mol^－1.L.cm^－1）

△A為吸光度變化

v為標(biāo)本體積（ml）

V為反應(yīng)體系體積（ml）

L為光徑（cm）

在實(shí)際測(cè)定中后面幾項(xiàng)皆為常數(shù)，所以上式常簡(jiǎn)化為：

（二）常數(shù)K的意義和設(shè)置

在測(cè)酶時(shí)，常數(shù)K值的選擇是很重要的。此值過高雖然測(cè)定的線性范圍較寬，但重復(fù)性差，反之，雖然精密度好，但線性窄。

此問題與儀器測(cè)定的嗓音（noise）密切相關(guān)，自動(dòng)分析儀吸光度讀數(shù)嗓音一般都需控制在0.001，也就是儀器須保證對(duì)同一溶液反復(fù)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，吸光度誤差最好控制0.001上下，雖然此值不大，但已可能使測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生1/1000K值的誤差，如K值為6000，代入上式，則每分鐘測(cè)定吸光度如有0.001微小變化，結(jié)果將是出現(xiàn)上下6U/L的誤差，對(duì)于一此參考值較低的酶，如轉(zhuǎn)氨酶而言顯然太大，臨床醫(yī)師無法容忍這么大差異。

K值設(shè)置的首先出發(fā)點(diǎn)應(yīng)是測(cè)定酶的判斷值或參考值上限，應(yīng)保證這些值測(cè)定的可靠，所以轉(zhuǎn)氨酶的常數(shù)K一般在3000左右，不少人寧愿在1500左右，另外還應(yīng)考慮到測(cè)定時(shí)間，一些半自動(dòng)分析儀測(cè)定時(shí)間短到0.5分，此時(shí)0.001嗓音對(duì)每分鐘△A誤差將是0.002，反之，測(cè)定時(shí)間延長(zhǎng)到2分鐘，誤差也小一半，也就是說，如測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，則K值可以設(shè)置大一些，如測(cè)定時(shí)間只有0.5分鐘，K值一般不超過4000。

改變K值最方便的途徑就是改變標(biāo)本稀釋度，稀釋倍數(shù)愈大，K值愈大。

（三）常數(shù)K值的檢驗(yàn)

摩爾吸光系數(shù)（ε）對(duì)一定物質(zhì)而言常是一個(gè)定值，但在一些外界條件影響下也會(huì)有所變化。最明顯例子是對(duì)硝基酚，隨pH不同，顏色差異明顯，當(dāng)pH＞10時(shí)，405nm處其ε為18500，在pH7.0，ε下降為9400，顏色下降幾乎一半。溫度變化時(shí)，也會(huì)對(duì)NAD(P)H的ε產(chǎn)生一些影響。當(dāng)波長(zhǎng)大于334nm時(shí)，隨溫度升高，同一波長(zhǎng)的ε值會(huì)輕度下降。

同時(shí)ε值是指用分光光度法，也就是在近似單色光的光源條件下才能成立，實(shí)際上大多數(shù)自動(dòng)分析儀使用的是干涉濾片，波峰值可能出現(xiàn)差異，個(gè)別的半波寬可能為10nm乃至更大。由于雜散光的存在，會(huì)明顯改變?chǔ)胖?，假如再考慮到注加系統(tǒng)的誤差，實(shí)測(cè)K值很可能與理論K值不一致。Onuki檢測(cè)了三臺(tái)Hitachi-7150型自動(dòng)分析儀測(cè)AST的K值分別為－5466、－5421、－5559。而理論K值為－6111則結(jié)果約增加為1.12倍。

測(cè)定實(shí)際的K值不是一件困難的事，目前有些自動(dòng)分析儀已有相應(yīng)的軟件和試劑可以進(jìn)行檢測(cè)。事實(shí)上對(duì)一些性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)如對(duì)硝基酚、對(duì)硝基苯胺，可以用高純?cè)噭┡涑蓸?biāo)準(zhǔn)品或直接購(gòu)買可靠的校準(zhǔn)品，將它們作為標(biāo)本進(jìn)行酶的測(cè)定，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度變化就可計(jì)算出實(shí)際K值，但此法不適用于測(cè)與NAD(P)H反應(yīng)有關(guān)酶測(cè)定的K值。因?yàn)镹AD(P)H不穩(wěn)定，此時(shí)可使用測(cè)葡萄糖的紫外分光光度法試劑盒，對(duì)已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行終點(diǎn)法測(cè)定，此法產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的NAD(P)H，故不難從吸光度變化求出K值，也有人用乳酸脫氫酶測(cè)已知量的丙酮酸來求K值。