臨床生物化學(xué)/連續(xù)監(jiān)測(cè)法與反應(yīng)進(jìn)程的分析
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從這個(gè)權(quán)威性的方法分類來看，前面所提到的二類測(cè)酶活性濃度方法都應(yīng)歸納為動(dòng)態(tài)法。目前廣為流行的“動(dòng)態(tài)法”命名顯然是不確切的或者是不合適的。應(yīng)該更多采用IFCC文件中建議的“連續(xù)監(jiān)測(cè)法”命名。
從酶反應(yīng)曲線來比較此二類方法。圖17-7是一個(gè)典型酶反應(yīng)過程。
圖17-7 酶促反應(yīng)中基質(zhì)［S］、產(chǎn)物［P］
和反應(yīng)速率V在不同時(shí)間變化的模式圖
在酶作用下，底物［S］濃度不斷下降，隨之有相應(yīng)產(chǎn)物［P］產(chǎn)生。不少酶在反應(yīng)一開始的階段，由于各種因素影響，反應(yīng)速度較慢，稱為延滯期，隨后在過量濃度的底物存在條件下，酶反應(yīng)以恒定的速度進(jìn)行，不受底物濃度變化的影響，這段反應(yīng)稱為線性反應(yīng)期或零級(jí)反應(yīng)期。隨時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)速度除與酶量有關(guān)，還與底物濃度有關(guān)。即v＝k(a－x)，式中a為原來底物濃度，x為消耗的底物濃度，如反應(yīng)物濃度項(xiàng)上指數(shù)為1，稱為一級(jí)反應(yīng)，假如反應(yīng)速率受二種或二種以上物質(zhì)濃度的影響，則各個(gè)反應(yīng)物濃度項(xiàng)上指數(shù)總和作為反應(yīng)級(jí)數(shù)，可以分別為一級(jí)、二級(jí)或多級(jí)反應(yīng)，總的將這段反應(yīng)時(shí)期稱為非線性反應(yīng)期。
很明顯如測(cè)反應(yīng)速度的目的是為了從此推算出酶含量的多少，則只有測(cè)線性反應(yīng)期的反應(yīng)速度才能作到此點(diǎn)。在延滯期、非線性期測(cè)的結(jié)果不準(zhǔn)確，一般是偏低的。
取樣法由于方法學(xué)上的限制，一般只測(cè)二管：一為沒發(fā)生酶反應(yīng)的對(duì)照管，另一管測(cè)酶作用一段時(shí)間后反應(yīng)物的變化，實(shí)際上測(cè)得是平均速度，而且二管間隔時(shí)間都較長(zhǎng)，在半小時(shí)左右，圖17-8中t0，t分別代表不同時(shí)間二管反應(yīng)物的量，雖然從t到t0反應(yīng)物變化量是相同的。但實(shí)際反應(yīng)過程是多種多樣的。
只有當(dāng)反應(yīng)如曲線A時(shí)，用“固定時(shí)間法”才能測(cè)出真實(shí)的酶活性，實(shí)際工作中是很少見的，圖中曲線B代表了最常見的反應(yīng)情況，在一個(gè)很短的線性反應(yīng)期后在大部分測(cè)定期間內(nèi)主要為非線性反應(yīng)期。曲線C說明在測(cè)定期間包括了延滯期，曲線D則不僅包括了延滯期，還包括非線性期，在這些反應(yīng)中如用固定時(shí)間法來測(cè)定，結(jié)果是不夠準(zhǔn)確的，一般是偏低的，而且酶濃度愈高，偏離程度愈大。
假如從上節(jié)敘述中得出一個(gè)重要結(jié)論：即在設(shè)計(jì)和選擇測(cè)定酶活性濃度方法時(shí)必須是在“最適條件”下測(cè)定最大反應(yīng)速度。那么從這段敘述中可得出一個(gè)對(duì)上述結(jié)論一個(gè)很重要的補(bǔ)充，即所測(cè)的最大反應(yīng)速度還應(yīng)該是初速度即V0。
理論上的V0在實(shí)際工作中是不存在的，必須讓酶和底物作用一段時(shí)間，消耗掉一定量的底物，才能測(cè)出反應(yīng)速度，一般說，如消耗底物在5％內(nèi)所測(cè)到的反應(yīng)速度都可認(rèn)為是初速度，如底物濃度很高時(shí)，底物消耗在20％以內(nèi)的反應(yīng)往往還在線性反應(yīng)期。
連續(xù)監(jiān)測(cè)法能滿足上述重要要求。由于不需停止酶反應(yīng)。很容易得到整個(gè)酶反應(yīng)曲線，然后根據(jù)反應(yīng)曲線情況，避開延滯期和非線性反應(yīng)期，只在線性反應(yīng)期測(cè)定最大反應(yīng)初速度。同時(shí)由于分光光度法的高靈敏度，自動(dòng)生化分析儀的高精密度，連續(xù)監(jiān)測(cè)法能在很短時(shí)間，甚至在1分鐘反應(yīng)時(shí)間，準(zhǔn)確測(cè)定反應(yīng)速度，從而求出準(zhǔn)確的酶活性濃度?！肮潭〞r(shí)間法”測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30分鐘，很難滿足上述方法學(xué)上測(cè)定初速度V0的要求。
圖17-8 二點(diǎn)測(cè)定法中可能引起的誤差
從理論上說，只有當(dāng)測(cè)定的是初速度，米氏方程式才能成立，并可能測(cè)出真正的Km。用“固定時(shí)間法”測(cè)出的速度受到逆反應(yīng)速度的影響。可以下式表示有逆向反應(yīng)存在時(shí)的酶反應(yīng)過程。
k1 k2 k3
E＋S→ES→EP→E＋P
← ← ←
K－1 k－2 k－3
存在著EP和P時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)逆反應(yīng)，此時(shí)所測(cè)的為一表觀速度（Va）或反應(yīng)的凈速度。
Va＝k2［ES］－k－2［EP］
［E］t代表酶總量，在反應(yīng)過程中包含了游離酶［E］、酶底物復(fù)合物［ES］和酶產(chǎn)物復(fù)合物［］EP］。
Ks為［ES］的解離常數(shù)，Kp為［EP］的解離常數(shù)，故：
代入上式得：
根據(jù)Maldanc公式Keq＝VfKp/VrKs得：
在反應(yīng)特定時(shí)間，產(chǎn)物［P］為一定值，上式得：
此公式從理論上說明，如所測(cè)反應(yīng)有逆反應(yīng)存在時(shí)，不存在原來的米-門方程式。用各種作圖法很難求出準(zhǔn)確的米氏常數(shù)。如果說所測(cè)酶反應(yīng)不僅存在著逆反應(yīng)，產(chǎn)物還抑制了酶反應(yīng)，則動(dòng)力學(xué)公式將更為復(fù)雜。這就是為什么不僅在建立方法時(shí)，就是在研究酶的動(dòng)力學(xué)時(shí)，也總是希望所測(cè)量的都是酶反應(yīng)的初速度。
以上這二類方法并不是概括了所有測(cè)酶活性濃度的方法，也并不排除在非線性反應(yīng)期測(cè)酶活性濃度的可能性。如固定底物變化量，則不同標(biāo)本達(dá)到此變化終點(diǎn)的時(shí)間，與酶量成反比例，Somogyi曾提出一種測(cè)淀粉酶的方法，酶與底物混合后。每隔半分鐘取一滴出來加入碘液呈色，觀察顏色由紫色變?yōu)榧t色時(shí)間，也就是淀粉酶全部水介變?yōu)?a href="/w/%E7%B3%8A%E7%B2%BE" title="糊精">糊精的時(shí)間，并由此時(shí)間的長(zhǎng)短計(jì)算出酶含量高低，這類方法不需使用很高濃度的底物，有其獨(dú)特之外，在自動(dòng)生化分析儀中也曾使用類似的方法，值得人們重視。
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