藥敏試驗(yàn)

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抗菌藥對(duì)細(xì)菌性傳染病的控制起到了非常重要的作用，但由于養(yǎng)殖過(guò)程中不科學(xué)的、盲目的濫用抗菌藥，很多致病性細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，使得抗菌藥對(duì)細(xì)菌性疾病的控制效果越來(lái)越差，不但造成藥物浪費(fèi)，而且還延誤病情，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。

隨著新型致病菌的不斷出現(xiàn)，抗菌藥的防治效果越來(lái)越差。并且各種致病菌對(duì)不同的抗菌藥物的敏感性不同，同一細(xì)菌的不同菌株對(duì)不同抗菌藥物的敏感性也有差異。長(zhǎng)期以來(lái)，各種致病菌耐藥性的產(chǎn)生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效，以及不能很好的掌握藥物對(duì)細(xì)菌的敏感度，所以一個(gè)正確的結(jié)果，可供臨床醫(yī)師選用抗菌藥物的參考，并提高療效。這就需要利用藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥物敏感度的測(cè)定，以便準(zhǔn)確有效的利用藥物進(jìn)行治療。但由于藥敏試驗(yàn)要求比較嚴(yán)格，條件比較高，僅僅在大中專院?；蚩蒲袉挝挥袟l件的可以操作，一些養(yǎng)殖廠或一些門診難有條件進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的操作。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動(dòng)物疫病診療中心經(jīng)過(guò)幾年的總結(jié)和實(shí)踐，逐漸總結(jié)出幾套適合基層進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的操作方法，現(xiàn)簡(jiǎn)單介紹如下?！　?/p>

實(shí)驗(yàn)步驟

一、實(shí)驗(yàn)材料

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：可去生化試劑店購(gòu)買，做不同細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)可選擇不同的培養(yǎng)基，如做大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)可選擇普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂或麥糠凱培養(yǎng)基。做沙門氏菌可選擇血清培養(yǎng)基。

藥敏試紙：購(gòu)買或自制（詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備）

細(xì)菌：待做藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌

儀器：接種環(huán)、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭　　

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

2.1　藥敏片的準(zhǔn)備：購(gòu)買或自制

2.1.1　制備方法：取新華1號(hào)定性濾紙，用打孔機(jī)打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。

2.1.2　抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶?jī)?nèi)加入藥液0.25毫升，并翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動(dòng)紙片時(shí)不能將紙片搗爛。同時(shí)在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過(guò)夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個(gè)月。

2.2　藥液的制備（用于商品藥的試驗(yàn)）：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液；如商品藥百病消按其說(shuō)明量治療量0.01%飲水，可按這個(gè)比例配制藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗(yàn)的藥液。　　

三、實(shí)驗(yàn)操作方法

3.1　藥敏片法

3.1.1　在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開(kāi)始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密）

3.1.2　將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。

3.1.3　將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。

3.2　牛津杯法

3.2.1　在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開(kāi)始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）

3.2.2　以無(wú)菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，并在小管處標(biāo)記各種藥物名稱。每個(gè)板可放4-6支小管。待分鐘后，分別向各小管中滴加一定數(shù)量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養(yǎng)8-18小時(shí)，觀察結(jié)果。

3.2.3　將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。

3.3　打孔法：

該法較簡(jiǎn)單，成本低，易操作，比較適用于商品藥物的檢測(cè)。

3.3.1　在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開(kāi)始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）

3.3.2　以無(wú)菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結(jié)果）。

3.3.3　加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。

3.3.4　將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果?！　?/p>

結(jié)果觀察

在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。過(guò)夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說(shuō)明該菌對(duì)此藥敏感性越大，反之越小，若無(wú)抑菌圈，則說(shuō)明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系?！　?/p>

判定標(biāo)準(zhǔn)

一、藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。

表1　藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

抑菌圈直徑（毫米）	敏感度
20以上	極敏
15~20	高敏
10~14	中敏
10以下	低敏
0	不敏

二、藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)參考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6-9毫米為低敏，無(wú)抑菌圈為不敏?！　?/p>

影響藥敏結(jié)果的因素

一、培養(yǎng)基：應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)菌的營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制。傾注平板時(shí)，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對(duì)氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。

二、細(xì)菌接種量：細(xì)菌接種量應(yīng)恒定，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

三、藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗(yàn)的結(jié)果，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴(yán)格按照其推薦治療量配制。

四、培養(yǎng)時(shí)間：一般培養(yǎng)溫度和時(shí)間為37℃ 8-18小時(shí)，有些抗菌藥擴(kuò)散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2~4小時(shí)，使抗菌藥預(yù)擴(kuò)散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細(xì)菌的生長(zhǎng)，而得到較大的抑菌圈?！　?/p>