藥敏試驗
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抗菌藥對細菌性傳染病的控制起到了非常重要的作用，但由于養(yǎng)殖過程中不科學的、盲目的濫用抗菌藥，很多致病性細菌產(chǎn)生了耐藥性，使得抗菌藥對細菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費，而且還延誤病情，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟損失。
隨著新型致病菌的不斷出現(xiàn)，抗菌藥的防治效果越來越差。并且各種致病菌對不同的抗菌藥物的敏感性不同，同一細菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性也有差異。長期以來，各種致病菌耐藥性的產(chǎn)生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效，以及不能很好的掌握藥物對細菌的敏感度，所以一個正確的結(jié)果，可供臨床醫(yī)師選用抗菌藥物的參考，并提高療效。這就需要利用藥敏實驗進行藥物敏感度的測定，以便準確有效的利用藥物進行治療。但由于藥敏試驗要求比較嚴格，條件比較高，僅僅在大中專院?；蚩蒲袉挝挥袟l件的可以操作，一些養(yǎng)殖廠或一些門診難有條件進行藥敏試驗的操作。針對這個問題，農(nóng)業(yè)部動物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動物疫病診療中心經(jīng)過幾年的總結(jié)和實踐，逐漸總結(jié)出幾套適合基層進行藥敏試驗的操作方法，現(xiàn)簡單介紹如下?！ ?/p>
目錄 |
實驗步驟
一、實驗材料
普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養(yǎng)基，如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養(yǎng)瓊脂或麥糠凱培養(yǎng)基。做沙門氏菌可選擇血清培養(yǎng)基。
藥敏試紙：購買或自制（詳見實驗準備）
細菌：待做藥敏試驗的細菌
儀器：接種環(huán)、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭
二、實驗準備
2.1 藥敏片的準備：購買或自制
2.1.1 制備方法：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。
2.1.2 抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液0.25毫升，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個月。
2.2 藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液；如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配制藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗的藥液?！ ?/p>
三、實驗操作方法
3.1 藥敏片法
3.1.1 在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密）
3.1.2 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。
3.1.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。
3.2 牛津杯法
3.2.1 在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）
3.2.2 以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，并在小管處標記各種藥物名稱。每個板可放4-6支小管。待分鐘后，分別向各小管中滴加一定數(shù)量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養(yǎng)8-18小時，觀察結(jié)果。
3.2.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。
3.3 打孔法：
該法較簡單，成本低，易操作，比較適用于商品藥物的檢測。
3.3.1 在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）
3.3.2 以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結(jié)果）。
3.3.3 加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。
3.3.4 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果?！ ?/p>
結(jié)果觀察
在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細菌生長受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關(guān)系?！ ?/p>
判定標準
一、藥敏實驗的結(jié)果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。
表1 藥物敏感實驗判定標準
| 抑菌圈直徑（毫米） | 敏感度 |
| 20以上 | 極敏 |
| 15~20 | 高敏 |
| 10~14 | 中敏 |
| 10以下 | 低敏 |
| 0 | 不敏 |
二、藥物敏感實驗判定標準參考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6-9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏?！ ?/p>
影響藥敏結(jié)果的因素
一、培養(yǎng)基：應根據(jù)試驗菌的營養(yǎng)需要進行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。
二、細菌接種量：細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。
三、藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結(jié)果，需精確配制。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配制。
四、培養(yǎng)時間：一般培養(yǎng)溫度和時間為37℃ 8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2~4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈?！ ?/p>
藥敏試驗的應用
藥物敏感實驗后，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給禽用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。
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