誘變
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誘變是指用物理、化學因素誘導植物的遺傳特性發(fā)生變異的方法，通常用于選育菌種、得到高產(chǎn)量植物種子等。
誘變操作其實很簡單，即用誘變劑直接或間接地處理生殖細胞。對細菌等生物而言，沒有體細胞與生殖細胞的區(qū)別，處理起來就更容易了。
誘變劑大致可分為四類。
一．物理誘變
物理誘變劑主要有紫外線，X—射線，γ-射線，快中子，激光，微波，離子束等。
1紫外線
我們知道，DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很強的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在260nm，因此波長260nm的紫外輻射是最有效的誘變劑.對于紫外線的作用已有多種解釋,但研究的比較清楚的一個作用是使DNA分子形成嘧啶二聚體,即兩個相鄰的嘧啶共價連接，二聚體出現(xiàn)會減弱雙鍵間氫鍵的作用,并引起雙鏈結(jié)構扭曲變形,阻礙堿基間的正常配對,從而有可能引起突變或死亡.另外二聚體的形成,會妨礙雙鏈的解開,因而影響DNA的復制和轉(zhuǎn)錄.總之紫外輻射可以引起堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失等［1］。
2γ-射線
γ-射線屬于電離輻射,是電磁波.一般具有很高的能量,能產(chǎn)生電離作用,因而能直接或間接地改變DNA結(jié)構.其直接效應是,脫氧核糖的堿基發(fā)生氧化,或脫氧核糖的化學鍵和糖-磷酸相連接的化學鍵斷裂,使得DNA的單鏈或雙鏈鍵斷裂.其間接效應是電離輻射使水或有機分子產(chǎn)生自由基,這些自由基與細胞中的溶質(zhì)分子起作用,發(fā)生化學變化,作用于DNA分子而引起缺失和損傷.此外,電離輻射還能引起染色體畸變,發(fā)生染色體斷裂,形成染色體結(jié)構的缺失、易位和倒位等［2］.
3激光
激光在微生物誘變育種方面的研究與開發(fā)應用比較晚。激光誘變育種技術研究始于20世紀60年代,經(jīng)過世界各國40多年的開發(fā)應用研究,不僅證明激光和普通光在本質(zhì)上都是電磁波,它們發(fā)光的微觀機制都與組成發(fā)光物質(zhì)的原子、分子能量狀態(tài)和變化密切相關。激光是一種與自然光不同的輻射光,它具有能量高度集中、顏色單一、方向性好、定向性強等特性。激光通過光效應、熱效應和電磁效應的綜合作用,能使生物的染色體斷裂或形成片斷,甚至易位和基因重組［3］。
4微波
微波輻射屬于一種低能電磁輻射,具有較強生物效應的頻率范圍在300MHz~300GHz,對生物體具有熱效應和非熱效應。其熱效應是指它能引起生物體局部溫度上升,從而引起生理生化反應;非熱效應指在微波作用下,生物體會產(chǎn)生非溫度關聯(lián)的各種生理生化反應。在這兩種效應的綜合作用下,生物體會產(chǎn)生一系列突變效應。因而,微波也被用于多個領域的誘變育種,如農(nóng)作物育種、禽獸育種和工業(yè)微生物育種,并取得了一定成果［4］。
5離子束
離子注入是20世紀80年代初興起的一項高新技術,主要用于金屬材料表面的改性。1986年以來逐漸用于農(nóng)作物育種,近年來在微生物育種中逐漸引入該技術。離子注入誘變是利用離子注入設備產(chǎn)生高能離子束(40~60keV)并注入生物體引起遺傳物質(zhì)的永久改變,然后從變異菌株中選育優(yōu)良菌株的方法。離子束對生物體有能量沉積(即注入的離子與生物體大分子發(fā)生一系列碰撞并逐步失去能量,而生物大分子逐步獲得能量進而發(fā)生鍵斷裂、原子被擊出位、生物大分子留下斷鍵或缺陷的過程)和質(zhì)量沉積(即注入的離子與生物大分子形成新的分子)雙重作用,從而使生物體產(chǎn)生死亡、自由基間接損傷、染色體重復、易位、倒位或使DNA分子斷裂、堿基缺失等多種生物學效應。因此,離子注入誘變可得到較高的突變率,且突變譜廣,死亡率低,正突變率高,性狀穩(wěn)定［5］。
二．化學誘變
化學誘變劑主要有烷化劑(包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、MNNG、NTG等),天然堿基類似物,氯化鋰、亞硝基化合物、疊氮化物、堿基類似物、抗生素、羥胺和吖啶等嵌入染料。
1烷化劑
烷化劑通常帶有1個或多個活性烷基,此基團能夠轉(zhuǎn)移到其它電子密度高的分子上去,使堿基許多位置上增加了烷基,從而在多方面改變氫鍵的能力。例如EMS被證明是最為有效而且負面影響小的誘變劑。與其他烷化誘變劑類似,是通過與核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反應來誘發(fā)突變。EMS誘發(fā)的突變主要通過兩個步驟來完成,首先鳥嘌呤的O6位置被烷基化,成為一個帶正電荷的季銨基團,從而發(fā)生兩種遺傳效應:一是烷化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對,代替胞嘧啶,發(fā)生轉(zhuǎn)換型的突變;二是由于鳥嘌呤的N27烷基活化,糖苷鍵斷裂造成脫嘌而后在DNA復制過程中,烷基化鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對,導致堿基替換,即G∶C變?yōu)锳∶T。當然,化學誘變存在著染色體結(jié)構和數(shù)量方面的誘導變異,但這種單一堿基對改變而形成的點突變仍是化學誘變的主要形式。另外，誘變劑也可與核苷結(jié)構的磷酸反應,形成酯類而將核苷酸從磷酸與糖分子之間切斷,產(chǎn)生染色體的缺失。這些DNA結(jié)構上的變化都可能促使不表達的基因或區(qū)段被激活,而表現(xiàn)出被掩蓋的性狀。
另外NTG也是最有效,用得最廣泛的化學誘變劑之一.依靠NTG誘發(fā)的突變主要是GC—AT轉(zhuǎn)換,另外還有小范圍切除、移碼突變及GC對的缺失.在自然條件下NTG容易分解,而在酸性(PH5.5)條件下會產(chǎn)生HNO2.雖然HNO2本身就是誘變劑,但在NTG有活性時(PH6~9),它卻無誘變效果.在堿性條件下,NTG會形成重氮甲烷(CH2N2),它是引起致死和突變的主要原因.它的效應很可能是CH2N2對DNA的烷化作用引起的［6］。
2天然堿基類似物
堿基類似物是與DNA正常堿基結(jié)構類似的化合物,能在DNA復制時取代正常堿基摻入并與互補堿基配對。如5-溴尿嘧啶(BU)和2-氨基嘌呤(AP),都能引起AT堿基對轉(zhuǎn)換為GC堿基對。
3氯化鋰
氯化鋰誘變，普遍認為是它導致AT-GC堿基對的轉(zhuǎn)換或?qū)е聣A基的缺失。
4疊氮化物
如疊氮化鈉( NaN3)NaN3等電點是pH=4. 18,在pH=3時NaN3溶液中主要產(chǎn)生呈中性的分子HN3,易透過膜進入細胞內(nèi),以堿基替換方式影響DNA的正常合成,從而導致點突變的產(chǎn)生。NaN3具有高效、無毒、便宜及使用安全等優(yōu)點。
5抗生素
如平陽霉素(PYM)，PYM是一種抗生素,屬于博萊霉素的一類。目前主要作為抗腫瘤藥應用于臨床,對多種癌癥具有較好的療效?？股鼐哂懈叨冗x擇性,能抑制細胞的生長,其中的大多數(shù)對維持生命有重要意義。作為一種新的誘變劑, 平陽霉素能直接作用于DNA,高濃度時可使DNA鏈斷開,低濃度時能抑制連接酶,阻止胸腺嘧啶核苷酸聚合入DNA,故抑制DNA的修復合成，PYM在許多實驗中均被證明具有安全、高效、誘變頻率高、范圍大等特點。與EMS的誘變特點相近,在某些方面優(yōu)于EMS,很具有開發(fā)和應用前景［7］。
6嵌入染料
如吖啶橙、溴化乙錠(EB)等可插入到DNA堿基對之間的染料,被稱作嵌入燃料，也是較強的誘變劑,能造成兩條鏈錯位或移碼突變。
三．空間技術誘變
近年來，人們利用宇宙系列生物衛(wèi)星、科學返回衛(wèi)星、空間站及航天飛機等空間飛行器，進行搭載微生物材料的空間誘變育種。通過外層空間特殊的物理化學環(huán)境，引起菌種的DNA 分子的變異和重組，從而得到生物效價更高的高產(chǎn)菌種。1987年以來,中國科學院微生物研究所等單位,先后利用衛(wèi)星搭載了真菌、酵母、放線菌、細菌等30多種微生物菌種,經(jīng)培殖后觀察發(fā)現(xiàn),處理后菌種的性狀均產(chǎn)生了一些變異,從中選擇培育出了一些能提高抗生素和酶產(chǎn)量的新菌種,現(xiàn)已投產(chǎn)應用。
空間環(huán)境導致作物遺傳變異的原因尚不完全清楚,一般認為空間誘變的主要因素有以下幾點。
1．微重力假說 在衛(wèi)星近地面空間條件下,環(huán)境重力明顯不同于地面,不及地面重力十分的微重力是影響飛行生物生長發(fā)育的重要因素之一，研究表明，微重力可能干擾DNA損傷修復系統(tǒng)的正常運行，即阻礙或抑制DNA斷鏈的修復。
2空間輻射假說 衛(wèi)星飛行空間存在著各種質(zhì)子、電子、離子、粒子、高能重粒子(HZE)、X—射線、γ-射線及其他宇宙射線。這些射線和粒子能穿透宇宙飛行器外壁,作用于飛行器內(nèi)的生物,產(chǎn)生很高的生物效應和有效的誘變作用。
3 轉(zhuǎn)座子假說
隨著基因組研究的深入和發(fā)展,中國科學院遺傳研究所的專家發(fā)現(xiàn)了新的誘變機制,即轉(zhuǎn)座子假說。該假說認為,太空環(huán)境將潛伏的轉(zhuǎn)座子激活,活化的轉(zhuǎn)座子通過移位、插入和丟失,導致基因變異和染色體畸變。這一新的發(fā)現(xiàn)為航天誘變育種機理研究增加了新的內(nèi)容,加速了航天誘變育種機理的研究進程［8］。
四．復合誘變
某一菌株長期使用誘變劑之后,除產(chǎn)生誘變劑“疲勞效應”外,還會引起菌種生長周期延長、孢子量減少、代謝減慢等,這對發(fā)酵工藝的控制不利,在實際生產(chǎn)中多采用幾種誘變劑復合處理、交叉使用的方法進行菌株誘變。
復合誘變包括:兩種或多種誘變劑的先后使用，同一種誘變劑的重復作用和兩種或多種誘變劑的同時使用.普遍認為,復合誘變具有協(xié)同效應.如果兩種或兩種以上誘變劑合理搭配使用復合誘變較單一誘變效果好. 如賀筱蓉等采用紫外同平板梯度濃度的亞硝基胍、純銅蒸氣混合誘變，篩選到高產(chǎn)菌株效價提高了53.2%，其原理可能是激光對經(jīng)理化處理的微生物細胞有修復作用，使正突變率提高。但也有復合誘變使效果降低的例子。如吳振倡等在相同的條件下銅蒸氣輻照龜裂鏈霉菌比其隨后又用氯化鋰復合處理效果好，可能是與氯化鋰提高了細胞的修復系統(tǒng)的活性有關［9］。
復合因子較單一因子誘變效果有很大優(yōu)勢.但因目前大多微生物,尤其是抗生素產(chǎn)生菌的遺傳背景不清楚,往往對誘變劑,特別是復合誘變劑的選擇使用,帶有很大的盲目性。
誘變的目的是為了得到新的突變。在摩爾根時代，遺傳學研究內(nèi)容的豐富與新突變的發(fā)現(xiàn)息息相關?，F(xiàn)在，遺傳學研究的內(nèi)容和手段與過去相比早已面目全非了，但獲得新突變并從中選出對人類有利的突變型仍然是熱點之一。培育新品種的方法現(xiàn)在已有許多新手段，如應用分子生物學技術培育轉(zhuǎn)基因動植物等，但誘變育種仍不失為簡便易行的常用手段。
繆勒不僅是人工誘變的創(chuàng)始人，也是第一位成功的誘變育種家。其實，他培育的CIB果蠅品系就是一個非常有用的果蠅新品種。20世紀30年代，瑞典的古斯塔夫松（Gustafsson）、尼布姆（Nybom）和哈格貝里（Hagbery）等就開始致力于誘變育種工作，并取得了較大成就。到50年代，瑞典已成為世界放射誘變育種研究的中心。60-70年代，誘變育種工作已成燎原之勢，經(jīng)誘變而得到的新品種已數(shù)不勝數(shù)。我國在60年代初開始誘變育種工作，進入80年代后，誘變育種工作與我國其它行業(yè)一樣進入了鼎盛時期。誘變育種的成果主要體現(xiàn)在作物育種和微生物育種兩方面。作物育種，目標致力于早熟、抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)。這些目標并不是一下子就能達到的，特別是與某些品質(zhì)有一定的相關性，如早熟的難以高產(chǎn)，高產(chǎn)的不早熟，這就須一步步地進行?？梢杂镁哂心撤N優(yōu)良品質(zhì)的品種作基礎，通過誘變，從中選出保持（甚至超過）該優(yōu)秀品質(zhì)并出現(xiàn)新的優(yōu)良品質(zhì)的突變體。如浙江培育的早熟水稻“原豐早”，就是以“科字6號”為基礎，經(jīng)誘變選擇而育成的。“原豐早”穗大粒多，耐肥抗倒，保留了“科字6號”的豐產(chǎn)品質(zhì)，但比后者早熟45天，從而產(chǎn)量比成熟期相同的其它品種高一成以上?！霸S早”還有適應性廣、早晚季均可種植、二熟制或三熟制都能適應的優(yōu)點。這類例子舉不勝舉，如湖北育成的“鄂麥6號”、山東育成的“魯棉1號”、黑龍江育成的“黑農(nóng)16號”大豆、廣東育成的“獅選64號”花生等，都是應用誘變而培育成功的。微生物育種，目標在于獲得高產(chǎn)菌株。許多生化藥物如核苷酸、酶制劑、氨基酸、抗生素等，常常用微生物發(fā)酵法來進行工業(yè)化生產(chǎn)。由于許多生化成分在生物組織中的含量較低、提取較為困難，所以這類藥物價格極昂貴。如果某種微生物代謝途徑改變，能累積這類成分，那么即可利用這種微生物來大量生產(chǎn)藥物。工業(yè)化生產(chǎn)的最大優(yōu)點是能大幅度降低藥物的生產(chǎn)成本，而誘變育種可以逐漸提高藥物產(chǎn)量，從而進一步降低成本。在我國許多生化制藥廠的抗生素生產(chǎn)車間里，都有著一批專門從事菌種培育的技術人員。正是由于他們的辛勤勞動，才使得各地的生產(chǎn)水平逐年提高。通過誘變育種，使藥物產(chǎn)量逐漸提高成千上萬倍的例子屢見不鮮。
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