臨床生物化學(xué)/反應(yīng)體系的最適pH、緩沖液的種類和濃度
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固定酶反應(yīng)的其它條件，在不同pH處測(cè)定酶反應(yīng)速度，可得各種類型的酶活性與pH關(guān)系見圖17-3A。
圖17-3A 酶活性與pH的函數(shù)關(guān)系曲線可能具有的幾種形狀
最常見的是（a）的對(duì)稱鐘形曲線，少數(shù)的如（b）（c）在一側(cè)即偏酸或偏堿處活性最高。生化學(xué)家將酶活性最高處的pH稱為最適pH。一般來說，血清中大多數(shù)酶最適pH接近中性（pH6.5-7.5）。有些酶在最適pH處活性變化尖銳明顯，也有些平坦寬廣。測(cè)定酶活性濃度時(shí)一定要選擇在最適pH處，不僅因?yàn)榇颂幟阜磻?yīng)速度最大，測(cè)定靈敏度最高，還因?yàn)榇颂幟富钚宰兓男甭首钚?，如反?yīng)體系中出現(xiàn)pH變化時(shí)，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響最小。
圖17-3B pH對(duì)酶活性及穩(wěn)定性的作用
曲線A：V對(duì)pH作圖曲線B：酶先在pH5及pH8預(yù)孵育后，在pH6.8測(cè)活性
氫離子可以通過多種途徑影響酶催化反應(yīng)。如在脫氫酶反應(yīng)中往往需要?dú)潆x子參加，也可能產(chǎn)生氫離子，從理論上可以將氫離子看成是該反應(yīng)的底物和產(chǎn)物之一。此外，當(dāng)pH變化時(shí)，可影響到底物、酶、酶-底物復(fù)合物的解離狀態(tài)和構(gòu)型，甚至還可能影響到各種輔因子，從而影響酶活性。
PH對(duì)酶還有一個(gè)重要的作用，就是影響酶的穩(wěn)定性。圖17-3B介紹一個(gè)有關(guān)實(shí)驗(yàn)。
圖中曲線A是最適pH實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，出現(xiàn)典型的鐘形曲線，其最適pH為6.8，高于或低于6.8時(shí)，酶反應(yīng)速度下降，下降原因可能與上述諸因素有關(guān)，但也可能由于酶穩(wěn)定性下降失活所致，或者是二類原因之總和。通過曲線B的實(shí)驗(yàn)，可將上述二類原因分清。此時(shí)先將酶與不同pH底物緩沖液溫育一段時(shí)間，此時(shí)間一般與測(cè)定時(shí)間相當(dāng)，然后再將pH調(diào)回最適pH處測(cè)其活性。從曲線B可以說在pH5-6.8以及pH6.8-8.0之間酶活性的下降與酶滅活關(guān)系不大，酶在最適pH處儲(chǔ)存常數(shù)穩(wěn)定。但有些酶貯存在最適pH時(shí)，并不一定比在其它pH處更穩(wěn)定。
最適pH并非是酶的特征性常數(shù)，易受多種因素影響而改變，如緩沖液的種類、底物濃度、溫度等，在研究pH對(duì)酶穩(wěn)定性影響還應(yīng)注意到酶濃度高低，在低濃度時(shí)，酶易解離為單體，常比多聚體更易滅活。還應(yīng)注意試劑中各種防腐劑和其它添加劑的影響。
最后必須強(qiáng)調(diào)的是本節(jié)討論的pH并不是指底物緩沖液的pH，而是底物和標(biāo)本混合后的pH對(duì)反應(yīng)速度的影響，由于實(shí)驗(yàn)室所測(cè)的標(biāo)本很少是純酶樣品，多為體液或組織粗提液。它們也是有一定pH值和緩沖能力的緩沖液，和底物緩沖液混后后，不一定維持住原來pH，特別是當(dāng)二溶液的pH相差甚遠(yuǎn)時(shí)，變化更大。例如堿性磷酸酶最適pH為10.2，雖然底物pH也是10.2，但血清標(biāo)本pH為中性，混合液的pH必然低于10.2，降低程度取決于血清的pH和緩沖能力。從而影響酶測(cè)定結(jié)果，臨床觀察證實(shí)：當(dāng)血清標(biāo)本放置過夜后用金氏法再測(cè)堿性磷酸酶時(shí)，結(jié)果常升高。有人認(rèn)為這與血清放置過長(zhǎng)，由于CO2逸出引起血清pH偏堿有關(guān)。
在下列情況極易引起混合液pH偏離底物緩沖液的pH：一是標(biāo)本用量太大，如以前有些方法，為節(jié)省底物，底物緩沖液用量和血清用量相等，此時(shí)混合液pH可能在此二液pH之間，有可能引起較大測(cè)定誤差。所以在文件中規(guī)定“標(biāo)本在總體積中的比例應(yīng)在10％以下”。就是要盡量減少標(biāo)本中各種物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。二是底物緩沖液緩沖能力太低。如金氏法測(cè)堿性磷酸酶時(shí)使用的碳酸鹽緩沖液的濃度為0.01mol/L，濃度這樣低的緩沖液，必定要受標(biāo)本pH的影響。
過去長(zhǎng)期以來，認(rèn)為緩沖液作用就是維持酶反應(yīng)的最適pH，忽視了緩沖物質(zhì)對(duì)酶反應(yīng)的其它作用和影響，Howell等研究了酶活性在三種不同緩沖液的變化情況見圖17-4。
圖17-4 各種緩沖液的溫度及pH的關(guān)系
TRIS：三羥甲基氨基甲烷0.1mol/L
TRA：三乙醇胺0.1mol/L
三種不同緩沖液不僅最適pH不一樣，最大反應(yīng)速度也有差異，從測(cè)定酶活性濃度角度，應(yīng)該選用枸櫞酸緩沖液，類似現(xiàn)象在大多數(shù)酶都能觀察到，僅是程度不同，其中以堿性磷酸酶活性受到緩沖液種類影響最為顯著，在二乙醇胺緩沖液所測(cè)酶活性約比在碳酸鹽緩沖液所測(cè)的高2倍。
由于緩沖液含有大量離子，或影響酶蛋白的構(gòu)型，或影響底物的解離程度等等，從而影響酶活性。Allert曾擬定了一種作用模式，并進(jìn)行數(shù)學(xué)計(jì)算，得出相應(yīng)方程式來說明反應(yīng)體系中電解質(zhì)會(huì)影響最大反應(yīng)速度V，且不同濃度電解質(zhì)的影響有差異。因此在方法設(shè)計(jì)時(shí)，選完緩沖物質(zhì)后，還必須了解不同濃度緩沖液對(duì)酶活性的影響。一般而言，隨緩沖液濃度增加，電解質(zhì)干擾酶和底物結(jié)合，酶活性將逐步下降，所以選擇緩沖液濃度時(shí)，常需在濃度較高以保持足夠緩沖能力和濃度較低以免抑制酶活性兩個(gè)相矛盾作用之間取得平衡。
在目前酶測(cè)定常用的一大類所謂生物緩沖物質(zhì)，如圖中的Tris、三乙醇胺受溫度影響較大。因此在我國(guó)學(xué)會(huì)文件中指出“配制緩沖液時(shí)不僅要指出其pH值，還應(yīng)說明配制溫度，以避免因溫度不同而引起的誤差?！痹诖藞D中還可看到，即使是同一種緩沖液，隨其它物質(zhì)存在，也有可能改變溫度的影響。因此在實(shí)際配制緩沖液時(shí)，應(yīng)首先將配制溶液溫度調(diào)節(jié)到規(guī)定溫度，然后在pH計(jì)監(jiān)測(cè)下加入相應(yīng)的酸或堿將溶液pH調(diào)到要求范圍。不控制溫度，不用pH計(jì)盲目按一些書提供的量配制緩沖液是不可取的。
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