醫(yī)學遺傳學/限制性核酸內(nèi)切酶

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醫(yī)學遺傳學基礎(chǔ)

基因診斷
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  - 限制性核酸內(nèi)切酶
  - 限制性片段長度多態(tài)性

限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease），又簡稱限制酶或內(nèi)切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。它們的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為從基因組中分離目的基因提供了必要的手段.限制酶能特異地識別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分離出來。

限制酶主要來源于原核生物，是一組能水解DNA磷酸二酯鍵的酶。迄今已發(fā)現(xiàn)的限制酶多達數(shù)百種，分為三類。在基因工程中使用的主要是第二類。限制酶根據(jù)其來源命名。例如，限制酶EcoRⅠ來源于大桿菌E.coli的RY13菌株,Ⅰ指在該菌株中分離的第一個限制酶。

下面是一些最常用的限制酶的來源及其識別順序(表13-1)

每種限制酶識別和切割的通常為4-6個核苷酸序列,稱為限制性位點(restriction sites)或切點.限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種，產(chǎn)生的末端也有兩種：第一種是交錯切割，即兩條鏈的切點不在同一水平而是相隔數(shù)個堿基，故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補的單鏈，這種末端容易互補連接，稱為粘性末端（cohesive terminus）；第二種為平整切割，即兩　

表13-1 常用的限制酶的來源及其識別順序列

名稱

識別序列

來源

Ava

C↓(	C	)CG(	A	)G
	T		G

Anabaena variabilis

Bam H

G↓GATCC

Bacillus amyloliquefaciens H

Bgl Ⅱ

A↓GATCT

Bacillus globigii

Eco RⅠ

G↓	*	ATTC
	A

Escherichia coliRY13

Eco RⅡ

↓CC(	A	GG
	T

Escherichia coliR245

HaeⅢ

GG↓	*	C
	C

Haemophilus aegyptius

HindⅢ

*	↓AGCTT
A

Hemophilus influenzae Rd

HpaⅠ

GTT↓AAC

Haemophilus parainfluenzae

HpaⅡ

C↓	*	GG
	C

同上

KpnⅠ

GGTAC↓C

Klebsiella pneumoniae

MboⅠ

↓GATC

Moraxella bovis

PstⅠ

CTGCA↓G

Providencia stuartii

被甲基化

條鏈在同一水平切開，得到平齊末端（blunt terminus）(圖13-2)。由于具有相同粘性

限制酶的兩類切割方式

圖13-2 限制酶的兩類切割方式

末端的DNA片段在DNA連接酶的作用下很容易共價連接，因此被廣泛地應(yīng)用于重組DNA操作中。具有相同平齊末端的DNA片段也可以連接，但連接效率只有粘性末端連接效率的1％。

限制酶的上述特性在基因工程和基因診斷中具有重要用途：①首先不論DNA的來源如何，用同一種內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的粘性末端很容易重新連接，因此很容易將人和細菌或人和質(zhì)粒任何兩個DNA片段連接在一起，即重新組合，這是重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)。②人類的基因組很大，不切割無法分析其中的基因。限制酶能把基因組在特異的部位切開，即切割不是隨機的，因而從每個細胞的基因組得到的是相同的一組長度各異的片段。這些可能含有某一基因的片段可用電泳分離，并加以研究。③由于限制酶的特異性，如果識別位點的堿基發(fā)生了改變，限制酶將不再能切割；同樣，堿基的改變也可能導致出現(xiàn)新的酸切位點。在人類基因組中，這兩種情況是十分常見的，而切點的消失或出現(xiàn)將影響獲得的DNA片段的長度，表現(xiàn)為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），這在基因的連鎖診斷中具有極重要的意義。